Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA's in zoogdiercellen
Summary
Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door fluorescent<em> In situ</em> Hybridisatie met bulk-poly (A) mRNA of specifieke transcripten detecteren.
Abstract
In eukaryoten meeste messenger RNA (mRNA) die coderen uitgescheiden en membraan eiwitten gelokaliseerd op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum (ER). Echter, de visualisatie van deze mRNA's een hele uitdaging. Dit geldt vooral wanneer slechts een fractie van de mRNA ER-geassocieerde en de distributie van dit organel wordt belemmerd door ongerichte (dwz "vrij") transcripten. Om ER-geassocieerde mRNA controleren, hebben wij een methode waarbij cellen worden behandeld met een korte blootstelling aan een digitonine extractieoplossing die selectief permeabilizes het plasmamembraan is waardoor het cytoplasmatische inhoud, terwijl ze tegelijkertijd de integriteit van de ER . Wanneer deze methode wordt gekoppeld met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), kan men duidelijk zichtbaar ER gebonden mRNA's door fluorescentiemicroscopie. Met dit protocol de mate van ER-vereniging voor bulk poly (A) transcripts of specifieke mRNAs kan worden geëvalueerden zelfs gekwantificeerd. In het proces kan men gebruik maken van deze assay de aard van mRNA-ER interacties te onderzoeken.
Introduction
In eukaryoten mRNA codeert uitgescheiden en membraaneiwitten kunnen worden gericht op de ER co-translationeel de signaalherkenning deeltje 1,2 en kan worden gehandhaafd op het ER via de directe interacties tussen ribosomen en translocons tijdens de vertaling 3,4. Maar of mRNA's kan worden gericht en onderhouden op de ER onafhankelijk van een van beide ribosomen of vertaling is niet duidelijk tot voor kort. Eerdere studies geprobeerd om aan te pakken of er sprake is translatie-onafhankelijke mRNA samenwerking met de ER met behulp van cellulaire fractionering technieken. Omdat agressieve chemische omstandigheden moesten ribosomen distantiëren van ER afgeleid blaasjes, die zouden kunnen verstoren de potentieel gevoelige mRNA-ER vereniging, deze studies waren niet overtuigend, waaruit blijkt voor 5-8 en tegen 9,10 ribosomaal-onafhankelijke verankering van mRNA naar de ER .
Om deze problemen te omzeilen hebben wij een protocol te isoleren en beeld ER-gebonden mRNA's. Deze procedure omvat een mild extractiebehandeling, die effectief verwijdert alle cytoplasmatische inhoud van de cel (inclusief niet-ER gebonden mRNAs) tegelijkertijd behoud van de morfologie ER en alle geassocieerde moleculen. Met dit protocol hebben we aangetoond dat een subset van mRNA gericht en onderhouden op ER onafhankelijk van ribosomen of translatie 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lokalisatie van mRNAs verschillende subcellulaire locaties, door de interactie van mRNA transcripten met lokalisatie eiwitten, is een veel voorkomend verschijnsel belangrijk voor de juiste sortering van eiwitten naar hun eindbestemming, en voor de fijnafstelling van genexpressie aan de plaatselijke eisen van een subcellulaire regio 19,20.
Met de assay hier beschreven we opnieuw de vraag of mRNA's die coderen voor secretie eiwitten kan worden gehandhaafd op de ER in de aanwe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science and Engineering Research Council van Canada om XAC en AFP
References
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Biochimie. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
