Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero
Summary
Qui si descrive un metodo per visualizzare reticolo endoplasmatico associate mRNA in cellule di mammifero coltura tissutale. Questa tecnica comporta la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina di rimuovere contenuto citoplasmatico seguite da fluorescente<em> In situ</emIbridazione> per rilevare sia bulk poly (A) o mRNA trascritti specifici.
Abstract
Negli eucarioti, la maggior parte degli RNA messaggeri (mRNA) che codificano proteine di membrana e secrete sono localizzati sulla superficie del reticolo endoplasmatico (ER). Tuttavia, la visualizzazione di questi mRNA può essere difficile. Ciò è particolarmente vero quando solo una frazione del mRNA è ER-associata e la loro distribuzione per questo organello è ostruita da non bersaglio (cioè "libero") trascritti. Per monitorare ER-mRNA associati, abbiamo sviluppato un metodo in cui le cellule vengono trattate con una breve esposizione ad una soluzione di estrazione digitonina che permeabilizes selettivamente la membrana plasmatica, e quindi rimuove i contenuti citoplasmatici, mantenendo al tempo stesso l'integrità del ER . Quando questo metodo viene accoppiato con ibridazione in situ fluorescente (FISH), si può chiaramente visualizzare ER-mRNA legati al microscopio a fluorescenza. Usando questo protocollo il grado di ER-associazione sia per sfusi poli (A) o trascritti specifici mRNA può essere valutatae anche quantificato. Nel processo, si può usare questo test per indagare la natura delle interazioni ER-mRNA.
Introduction
Negli eucarioti, la codifica mRNA secreta e proteine di membrana possono essere mirati al pronto soccorso co-traduzionale dal 1,2 particella di riconoscimento del segnale e possono essere mantenuti al pronto soccorso tramite le interazioni dirette tra ribosomi e translocons durante la traduzione 3,4. Tuttavia, se mRNA può essere mirata e mantenuto sul indipendente di ER sia ribosomi o traduzioni non era chiaro fino a poco tempo fa. Studi precedenti ha tentato di affrontare l'esistenza di traduzione-associazione indipendente mRNA con l'ER con tecniche di frazionamento cellulare. Poiché le condizioni chimici aggressivi sono stati tenuti a dissociarsi da ribosomi ER vescicole derivate, che possono influenzare negativamente il delicato potenzialmente mRNA-ER associazione, questi studi sono stati inconcludenti, fornendo prove per 5-8 e contro 9,10 ribosomiale-fissaggio indipendente di mRNA al pronto soccorso .
Per aggirare questi problemi, abbiamo sviluppato un prototipocol di isolare e di immagine ER-bound mRNA. Questa procedura comporta un blando trattamento di estrazione, che rimuove efficacemente tutto il contenuto citoplasmatico della cellula (anche non ER-bound mRNA) preservando al tempo stesso la morfologia ER e tutte le sue molecole associate. Usando questo protocollo abbiamo dimostrato che un sottoinsieme di mRNA sono mirati e poi mantenuto sul ER indipendentemente ribosomi o traduzione 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La localizzazione di mRNA per vari siti subcellulari, attraverso l'interazione con proteine di trascritti di mRNA di localizzazione, è un fenomeno diffuso importante per il corretto smistamento delle proteine alla loro destinazione finale, e per la messa a punto di espressione genica ai requisiti locali di un subcellulare regione 19,20.
Utilizzando il test qui descritto, abbiamo rivisitato la questione se mRNA che codificano proteine secretorie può essere m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Science and Engineering Research Council of Canada a XAC e AFP
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