Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente<em> In situ</emHibridación> a detectar sea a granel poli (A) mRNA o transcripciones específicas.
En eucariotas, la mayoría de los ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas de membrana y secretada están localizados en la superficie del retículo endoplásmico (ER). Sin embargo, la visualización de estos mRNAs puede ser un reto. Esto es especialmente cierto cuando sólo una fracción del ARNm es ER-asociado y su distribución a este orgánulo es obstruida por no objetivo (es decir, "libre") transcripciones. A fin de supervisar ER-asociados mRNAs, hemos desarrollado un método en el que las células se tratan con una corta exposición a una solución de extracción que digitonina selectivamente permeabiliza la membrana plasmática, y por lo tanto elimina los contenidos citoplásmicos, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la ER . Cuando este método se acopla con hibridación in situ fluorescente (FISH), uno puede visualizar claramente ER-mRNAs unidos por microscopía fluorescente. Usando este protocolo el grado de ER-asociación, ya sea para granel de poli (A) o transcripciones de ARNm específicos puede evaluarsee incluso cuantificados. En el proceso, se puede utilizar este ensayo para investigar la naturaleza de las interacciones ER-mRNA.
En eucariotas, el ARNm que codifica secretadas y proteínas de membrana pueden ser dirigidos a la ER co-traduccional por la partícula de reconocimiento de señal de 1,2 y se puede mantener en el ER a través de las interacciones directas entre los ribosomas y translocons durante la traducción 3,4. Sin embargo, si mRNAs pueden ser dirigidos y mantenidos en la sala de emergencia independiente de cualquiera de los ribosomas o la traducción no está claro hasta muy recientemente. Estudios previos tratado de abordar la existencia de traducción independiente de la asociación con el mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamiento celular. Debido a las duras condiciones químicas se requiere para disociar los ribosomas de ER vesículas derivadas, que pueden bloquear la potencialmente delicada ARNm-ER asociación, estos estudios no fueron concluyentes, proporcionando evidencia de 5-8 y 9,10 contra ribosomal independiente de anclaje de ARNm al ER .
Para superar estos problemas, se ha desarrollado un protopara aislar y col imagen ER-enlazados mRNAs. Este procedimiento consiste en un tratamiento de extracción suave, que elimina eficazmente todo el contenido citoplasmático de la célula (incluyendo los no consolidados ER-mRNAs) y al mismo tiempo preservar la morfología de ER y de todas sus moléculas asociadas. Usando este protocolo, hemos demostrado que un subconjunto de mRNAs están dirigidos y después se mantuvo en el ER independientemente de los ribosomas o la traducción 11.
La localización de los ARNm a varios sitios subcelulares, a través de la interacción con las proteínas de las transcripciones de ARNm de localización, es un fenómeno generalizado importante para la selección adecuada de las proteínas a su destino final, y para el ajuste fino de la expresión de genes a los requisitos locales de una subcelular 19,20 región.
Usando el ensayo descrito aquí, se volvió a examinar la cuestión de si los ARNm que codifican proteínas de secrec…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science and Engineering Research Council de Canadá a XAC y AFP