כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון<em> באתר</em> הכלאה לזהות או פולי תפזורת () mRNA או תעתיקים ספציפיים.
באאוקריוטים, רוב RNAs השליח (mRNAs) המקודדים מופרשת והחלבונים בממברנה מותאמת לשפה מקומיים על פני השטח של reticulum endoplasmic (ER). עם זאת, להדמיה של mRNAs אלה יכול להיות מאתגרות. זה נכון במיוחד כאשר רק חלק קטן מן mRNA הוא ER-משויך והפצתם לאברון זה הנה חסום על ידי תמלילים שאינם ממוקדים (כלומר "חופשי"). על מנת לפקח mRNAs ER-נלווה, פתח שיטה שבה תאי מטופלים עם חשיפה קצרה לפתרון חילוץ digitonin כי סלקטיבי permeabilizes קרום הפלזמה, ובכך מסיר את תוכן cytoplasmic, תוך שמירה על שלמות ER . כאשר שיטה זו היא בשילוב עם ניאון כלאה באתר (FISH), אפשר לחזות באופן ברור mRNAs ER-כפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות פרוטוקול זה המידה של ER-עמותה לאו תעתיקי תפזורת פולי () או mRNAs הספציפי ניתן להעריךואפילו לכימות. בתהליך, אפשר להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור את טבעו של אינטראקציות mRNA-ER.
באאוקריוטים, קידוד ה-mRNA מופרש וחלבוני קרום יכולים להיות ממוקדים לחדר מיון השיתוף translationally ידי 1,2 חלקיק הכרת האות ואפשר לקיים ER דרך האינטראקציות הישירות בין הריבוזומים וtranslocons במהלך תרגום 3,4. עם זאת, האם יכול להיות ממוקד mRNAs ומתוחזק על ER העצמאי או הריבוזומים או תרגום לא היה ברור עד לאחרונה. מחקרים קודמים ניסו לענות האם יש קשר תרגום עצמאי mRNA עם ER באמצעות טכניקות חלוקה תאיות. בגלל תנאים כימיים קשים נדרשו לנתק את הריבוזומים משלפוחית ER נגזר, שעשוי לשבש את ה-mRNA-ER העדינה פוטנציאלי העמותה, מחקרים אלה לא היו חד משמעיים, הוכחה ל5-8 ונגד 9,10 עיגון ריבוזומלי עצמאי של mRNA לחדר המיון .
כדי להתגבר על בעיות אלו פתחנו פרוטוcol לבודד ותמונה mRNAs ER-כפות. הליך זה כרוך טיפול חילוץ קל, שמסיר ביעילות את כל תוכן cytoplasmic של התא (כולל mRNAs אינו ER-כפות) תוך שמירה על מורפולוגיה ER וכל המולקולות הקשורים אליו. באמצעות פרוטוקול זה אנו מראים כי קבוצת משנה של mRNAs ממוקדות ולאחר מכן שמרה על חדר המיון באופן עצמאי או תרגום של הריבוזומים 11.
הלוקליזציה של mRNAs לאתרי subcellular שונים, באמצעות האינטראקציה של תמלילים עם חלבוני לוקליזציה mRNA, היא תופעה נפוצה חשובה למיון הנכון של חלבונים ליעד הסופי שלהם, ולכוונון העדין של ביטוי גנים לדרישות המקומיות של subcellular אזור 19,20.
באמ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהלאומיים למדע והנדסת מועצת המחקר של קנדה לXAC וAFP