Здесь мы опишем метод визуализации эндоплазматическая сеть связанных мРНК в клетках млекопитающих культуре ткани. Эта методика включает в себя селективный проницаемости плазмы мембраны с дигитонина удалить цитоплазматического содержимого последующим флуоресцентным<em> На месте</em> Гибридизации для выявления объемных или поли (А) мРНК или конкретных стенограммы.
У эукариот, большинство из РНК, (мРНК), которая кодирует выделяется и мембранные белки локализованы на поверхности эндоплазматической сети (ER). Тем не менее, визуализации этих мРНК может быть сложной задачей. Это особенно верно, когда только часть мРНК ER-ассоциированных и их распределение этой органеллы затруднен нецелевой (т.е. "свободный") стенограмм. В целях контроля ER-связанных мРНК, мы разработали метод, при котором клетки обрабатывают с коротким воздействием решение дигитонина добычи, избирательно permeabilizes плазматической мембраны, и таким образом снимает цитоплазматического содержимого, при одновременном сохранении целостности ER . Когда этот метод в сочетании с флуоресцентной гибридизации (FISH), можно четко визуализировать ER-связанного мРНК методом флуоресцентной микроскопии. С помощью этого протокола степени ER-ассоциации либо объемных поли (А) транскриптов или конкретных мРНК может быть оцененаи даже количественно. В этом процессе можно использовать этот анализ для исследования природы мРНК-ER взаимодействия.
У эукариот мРНК, кодирующей выделяется и мембранных белков могут быть направлены на ER совместно трансляционно частицей 1,2 признание сигнала и может быть сохранен на ER через прямое взаимодействие между рибосомами и translocons во время перевода 3,4. Однако, независимо от мРНК могут быть направлены и поддерживается на ER зависит ни от рибосомы или перевода была неясна до самого последнего времени. Предыдущие исследования пытаются решить, есть ли перевод независимой мРНК связи с использованием ER сотовой методы фракционирования. Из-за суровых условиях химического должны были отделиться от рибосомы ER, полученных пузырьков, которые могут нарушить тонкий потенциально мРНК-ER ассоциации, эти исследования не дали результатов, что свидетельствует в течение 5-8 и против 9,10 рибосомных независимых закрепления мРНК ER .
Чтобы обойти эти проблемы мы разработали протоцв, чтобы изолировать и изображения ER-связанного мРНК. Эта процедура включает в себя мягкий лечения добычи, которая эффективно удаляет все цитоплазматического содержимого ячейки (в том числе не связанных ER-мРНК) при одновременном сохранении ER морфологии и все связанные с ней молекулы. С помощью этого протокола мы продемонстрировали, что подмножество мРНК ориентированы, а затем поддерживается на ER независимо от рибосомы или перевод 11.
Локализация мРНК в различных субклеточных сайтов, через взаимодействие с белками стенограммы мРНК локализации, является широко распространенным явлением важна для правильной сортировки белков в конечный пункт назначения, а также для тонкой настройки экспрессии генов в местные треб?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Национального научного и инженерного исследовательского совета Канады XAC и AFP