Summary
Aquí se describe un método eficaz para estudiar la dinámica de aclaramiento celular apoptótica
Abstract
La eliminación adecuada de las células no deseadas o aberrantes mediante apoptosis y la posterior fagocitosis (aclaramiento de las células apoptóticas) es crucial para el desarrollo normal en todos los organismos metazoos. Aclaramiento celular apoptótica es un proceso muy dinámico íntimamente asociada con la muerte celular, las células apoptóticas unengulfed apenas se observan in vivo en condiciones normales. Con el fin de entender los diferentes pasos de aclaramiento celular apoptótica y de comparar los fagocitos "profesionales" - macrófagos y las células dendríticas a 'no profesional' - células vecinas tejido residentes, en vivo de imágenes en vivo del proceso es extremadamente valiosa. Aquí se describe un protocolo para el estudio de aclaramiento celular por apoptosis en embriones de Drosophila vivas. Para seguir la dinámica de los diferentes pasos en la fagocitosis que utilizamos marcadores específicos de células apoptóticas y los fagocitos. Además, podemos controlar dos sistemas de fagocitos en paralelo: los macrófagos "profesionales" y "semi-profeglía ssional 'en el sistema nervioso central en desarrollo (SNC). El método descrito aquí utiliza el embrión de Drosophila como un excelente modelo para estudios en tiempo real de despacho de las células apoptóticas.
Introduction
La eliminación adecuada de las células no deseadas o aberrante a través de la apoptosis y la subsiguiente fagocitosis es crucial para el desarrollo embrionario, así como para la homeostasis del tejido en el adulto. La fagocitosis de las células apoptóticas o el aclaramiento celular por apoptosis es un proceso muy dinámico que se desarrolla en cuatro etapas: (1) la contratación de los fagocitos a la célula apoptótica ("find-me»), (2) el reconocimiento de la célula como un objetivo para la fagocitosis ( "comer-me ') y (3) inmersión, seguido de (4) la maduración del fagosoma y la degradación de la partícula apoptosis 1-5. Hay dos tipos de fagocitos: macrófagos "profesionales" y las células dendríticas inmaduras, y el "no profesionales" células de tejidos vecinos residentes, que son cruciales para la remoción de células apoptóticas durante el desarrollo metazoos 6,7.
En el desarrollo de Drosophila, la eliminación de células superfluas a través de la apoptosis se produce en tres mfases Ain, por primera vez en la segunda mitad de embriones tarde, entonces a mediados de pupa, y de nuevo a principios del adulto. Durante la embriogénesis partículas apoptóticas son eliminados por los fagocitos "profesionales", los macrófagos y por ectodermo y glia 8,9 «no profesional».
En nuestro trabajo anterior hemos identificado un receptor fagocítico, seis micras-bajo (SIMU), que se expresa exclusivamente en las células fagocíticas durante la embriogénesis. Utilizando el promotor simulación que generó un marcador específico de las poblaciones de células fagocíticas (simu-cytGFP) lo que nos permite monitorear los macrófagos, ectodermo y glia simultáneamente en un concierto embrión en desarrollo 8. Además, mediante el uso de marcadores específicos para células apoptóticas en diferentes etapas de la apoptosis, somos capaces de seguir la dinámica de aclaramiento celular apoptótica in vivo.
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Protocol
Para seguir la dinámica de la liquidación de apoptosis de células in vivo dos poblaciones de células deberá contener: los fagocitos y las células apoptóticas.
Con motivo de las poblaciones de células fagocíticas que utilizamos una línea de Drosophila que contiene el marcador simular cytGFP, que las etiquetas de las células fagocíticas exclusivamente en el embrión: macrófagos, células gliales y ectodermo 8. Se pueden utilizar diferentes marcadores de las células fagocíticas, incluidas las líneas que contienen un controlador Gal4 hemocyte específico (CRQ-Gal4) o células gliales específicos Gal4 conductor (repo-Gal4) y un reportero fluorescente codificada genéticamente bajo control UAS (UAS-GFP).
Para controlar las células apoptóticas durante el despacho celular apoptótica usamos diferentes apoptosis / marcadores fagocitosis. Anexina V (Molecular Probes) sirve como un marcador temprano de células apoptóticas 10; Phiphilux (OncoImmunin) es un sustrato fluorogénico de caspasa-3, que se utiliza como una apoptosis más tardesis marcador, y LysoTracker (Molecular Probes) funciona como un marcador fagosoma. Se inyecta estos reactivos utilizando el sistema de microinyección PicoPump PV 820.
1. Preparándose
- Pegamento Heptano:
Desenrolle la cinta de doble cara y poner todo lo que puede en un vial de centelleo, se llenan de heptano, cerrar el vial con Parafilm y rock durante 24 horas. Añadir heptano si el pegamento es demasiado grueso. - Permitimos que las moscas ponen en una uva precalentado jugo de la placa de agar + levadura pegue durante 2 horas y, a continuación, transferir la placa a 25 ° C durante 10-12 horas (depende de la etapa deseada) antes de la microinyección y el tiempo de grabación de lapso de los embriones inyectados. Recopilamos embriones de las placas de agar mantenido a 25 ° C, proporcionando de este modo embriones de la etapa 15 o 16 de desarrollo.
- Preparación de la aguja:
Para preparar agujas para inyección, se utiliza un "instrumento Sutter 'extractor de agujas y filamentos de vidrio de paredes delgadas (tubo capilar FHC). La punta del capilar combinado está roton para un diámetro de 0,5-2 micras. - Cubreobjetos con pegamento:
Utilizando una punta de pipeta de dispersar una gota del pegamento heptano en una línea en el centro del cubreobjetos. Deje que se seque durante unos segundos. Prepare algunas de estas cubreobjetos.
2. Preparación de embriones
- Recoger embriones a partir de placas de agar y transferirlos a un filtro de células (SPL Life Sciences) usando un cepillo de pintura limpio y agua corriente. El filtro se coloca sobre un vaso para recoger las aguas residuales.
- Lave los embriones en el filtro de células con agua hasta eliminar toda la pasta de levadura.
- Secar el exceso de agua frotando la parte exterior del filtro usando Kimwipes.
- Coloque el filtro de células en una placa de Petri limpia y agregue suficiente 50% de lejía para cubrir embriones en el filtro celular. Dechorionate los embriones durante 2 min en ocasiones (2-3 veces) agitando.
- Enjuague con agua exhaustivamente hasta embriones sueltas el olor a cloro.
- Coloque el filtro de células en un recipiente limpioPlaca de Petri y cubrir los embriones con agua para evitar que se seque para arriba.
- Antes de iniciar el ajuste de los embriones, la carga 1 l de reactivo deseado en dos agujas (a veces una aguja puede estar obstruida). Se tarda unos 5 minutos para que el líquido para llegar a la punta de la aguja.
- Corte un pedazo rectangular de agar jugo de uva y colocarlo en un portaobjetos de microscopio. Transferencia de embriones dechorionated de la placa de Petri con la pieza agar usando un pincel limpio.
- Bajo un microscopio de disección fluorescente seleccionar adecuadamente por etapas embriones que expresan el marcador GFP usando un cepillo de pintura húmeda y colocar cada embrión cerca del borde de la pieza de agar en una fila uno tras otro (Figura 1A). Los embriones se colocan con su lado ventral hacia arriba para la fagocitosis de imágenes por la glía en el sistema nervioso central (SNC).
- Establecer unos 10 embriones en una fila.
- Fije los embriones a un cubreobjetos recubierto en el centro con una tira de la cola heptano (Figura 1B, C
- Coloque el cubreobjetos en la cámara de deshidratación durante aproximadamente 5 min (esto depende de la humedad de la habitación y la cantidad a inyectar).
- Después de secar a cubrir los embriones con aceite de halocarbonos 700 (Sigma) para evitar una mayor deshidratación.
- Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio con los embriones hacia arriba. Usted puede poner una gota de agua en la diapositiva para evitar que se mueva del cubreobjetos. Los embriones están listos para la inyección. Ubicación de inyección es típicamente en el lado lateral en el centro del embrión.
3. Inyección de Embriones
- Coloque la aguja a un micromanipulador.
- Para romper la punta de la aguja puso el borde del cubreobjetos en el campo de visión y ajustar la aguja en el mismo plano focal. Muy mueva con cuidado el cubreobjetos hasta que llega a la punta de la aguja y la rompe.
- Centrándose en los embriones, colocar la aguja en el aceite y asegúrese de obtener una gota de líquido de la aguja. Esto significa que la punta de la aguja ha sidoroto también.
- Sin tocar el soporte de la aguja mover el embrión en la aguja e inyectar una gota en el embrión. Mueva el embrión de distancia y proceder a la siguiente hasta que se inyectan todos los embriones.
4. Imágenes
Nos la imagen de los embriones en un microscopio confocal invertido con un objetivo de 40X o 100X. Buscamos un embrión bien situada, el SNC en el medio, que muestra una fuerte expresión GFP y un buen etiquetado de las células apoptóticas después de la inyección.
Por tiempo de grabación de lapso de embriones vivos que solemos elegir 5 o 6 rebanadas confocal (2 micras de espesor cada una). Después, se hace una proyección de 3 rebanadas (6 m de espesor) con el fin de observar las células enteras.
Utilizamos marcadores de apoptosis, que son estables y no blanquear fácilmente. Para evitar GFP blanqueo hacemos grabaciones en intervalos de 60 segundos.
En algunos casos, los embriones pueden comenzar a rodardurante el tiempo de grabación de vídeo. Por lo tanto, damos un vistazo de vez en cuando en el registro con el fin de parar y empezar de nuevo si es necesario.
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Representative Results
Marcos representativos de una película en la que las células apoptóticas se etiquetan con Anexina V, y glía, ectodermo y los macrófagos se marcaron con simula-cytGFP se muestran en la Figura 2. Cada cuadro es una proyección de 3 rebanadas de 2 micras cada una.
El embrión de la etapa 15 está colocada adecuadamente mostrando el SNC de embriones en el medio con glía bien marcado (g). Los macrófagos (m), en su mayoría fuera del SNC, muestran una fuerte expresión GFP citoplasmática. Células ectodérmicas también están etiquetados con GFP citoplasmática (e). Muchas células positivas Anexina V se observan dentro y fuera del SNC. Para seguir el evento de inmersión no es fácil. Destacamos un evento con un rectángulo blanco en una célula glial se cierne sobre una partícula de apoptosis. Tenga en cuenta el comportamiento de prueba de la célula glial: tocar la partícula apoptótica un par de veces sin que envuelve y luego terminar con inmersión de la anexina V etiquetados células apoptóticas (Figura 2
Marcadores adicionales para las diferentes etapas de apoptosis se podrían utilizar con el mismo procedimiento.
Figura 1. Representación esquemática de la preparación para la microinyección de embriones. A. Una diapositiva microscópica que contiene un trozo de agar en la que los embriones se transfieren después dechorionation. Acerca de 20 embriones se colocan en línea, cerca del borde de la pieza de agar, con su lado ventral hacia arriba, para la formación de imágenes del SNC. B. Un cubreobjetos que contiene una tira de pegamento heptano en el medio. C. El cubreobjetos de B con embriones unido a la tira de pegamento heptano.
Figura 2. Análisis dinámico del aclaramiento celular apoptótica. Grabación Time-lapses del despacho de células apoptóticas en un embrión en su fase 15. Glía (g), los macrófagos (m) y ectodermo (e) se marcan con simu-cytGFP (verde). Las células apoptóticas se marcan con el fluorescente Anexina V (rojo). A. fotogramas seleccionados de una película representativa se muestran. Una célula glial que envuelve una célula apoptótica se representa por un rectángulo. B. Cierre de vistas del rectángulo marcado.
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Discussion
Aclaramiento celular apoptótica es una última etapa crítica de la apoptosis, la cual es altamente dinámico. Por lo tanto los estudios en tiempo real del proceso son de suma importancia. Aquí se describe un protocolo que permite la supervisión del despacho de células apoptóticas en el desarrollo de embriones de Drosophila vivir. En este procedimiento, dos poblaciones de células deben marcarse mediante marcadores específicos: las células apoptóticas y los fagocitos. El reportero simular cytGFP es adecuado para el seguimiento de los macrófagos fagocíticas, células gliales y ectodermo simultáneamente en el mismo embrión, w hich hace que sea posible seguir diferentes poblaciones de células fagocíticas en el mismo tiempo. Esta es una gran ventaja para el estudio de despacho "profesional" y "no profesional" al mismo tiempo, la comparación de los aspectos específicos del proceso, tales como la velocidad, la especificidad y la capacidad de degradación. Una desventaja de este enfoque es que el marcador simular cytGFP se expresa muy fuertemente en los macrófagos y mucho más débil englía, lo que podría ser difícil de ajustar en la misma película. Sin embargo, se pueden tomar imágenes de liquidación de apoptosis celular por macrófagos por separado de este proceso en el sistema nervioso central, por la conducción de la expresión de GFP con Gal4s específicos (CRQ-Gal4 de macrófagos y repo-Gal4 de glia).
Los diferentes marcadores de apoptosis que reflejan alteraciones moleculares y morfológicas específicas son de gran valor para la comprensión de la dinámica y la reversibilidad de la apoptosis y la limpieza celular. Por otra parte, las grabaciones en tiempo real de aclaramiento celular apoptótica utilizando estos marcadores añaden información adicional acerca de fenotipos mutantes, que no se podrían alcanzar mediante el uso de técnicas de inmunohistoquímica convencionales en embriones fijos.
El paso más difícil del protocolo descrito, cuando se generan imágenes del SNC en desarrollo, es el posicionamiento extremadamente preciso de los embriones antes de la inyección. Incluso un ligero movimiento del cubreobjetos durante la unión del preparadoembriones a la cola podrían cambiar su posición, lo que no sería apropiado para la formación de imágenes del SNC. El embrión operación de unión se debe realizar con la máxima atención.
Desarrollo de marcadores adicionales para determinadas fases de la apoptosis y la fagocitosis sería extremadamente deseable para la disección más fina y la posible manipulación de aclaramiento celular apoptótica. El protocolo presentado aquí sirve como una buena base para el desarrollo futuro.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una Marie Curie Reintegración Grant (IRG249084). Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Kurant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
