Summary
ここでは、高品質のビタミン/ RBP複合体とSTRA6、RBP受容体によってビタミンAの輸送を研究するには、2つのリアルタイム·モニタリング技術を生成するように最適化手法を説明します。
Abstract
ビタミンAは視力とほぼすべての人間の器官の成長/分化に必須である。血漿レチノール結合タンパク質（RBP）は、原則とビタミン血液中の特定のキャリアである。ここで我々が生産し、高親和性受容体RBP STRA6によるビタミンの輸送を研究するためにホロRBPと2つのリアルタイム·モニタリング技術を浄化するための最適化手法について述べる。最初の方法は、それが可能な高品質のビタミンのためのホロRBP（100レチノール％ロード）輸送アッセイを大量に製造することができる。ミスフォールドRBPリリースビタミン容易にし、汚染細菌RBP準備ではアーチファクトを引き起こす可能性があるので、高品質のRBPは機能アッセイのために不可欠です。電気生理学のようなリアルタイムのモニタリング技術は膜輸送の研究に重要な貢献をしてきました。 RBP受容体媒介性のレチノール輸送はリアルタイムで最近まで分析されていません。ここで説明する2番目の方法はREAですSTRA6触媒によるレチノールリリースや負荷のl時間分析。第3の方法は、細胞のレチノール結合タンパク質I（CRBP-I）にホロRBPからSTRA6触媒によるレチノール輸送のリアルタイム分析である。これらの技術は、RBP受容体のビタミン取り込み機構を明らかにすることで、高感度と分解能を提供します。
Introduction
ビタミンAは、人類の生存と、ほとんどすべての人間の臓器を適切に機能させるために不可欠である有機分子である。ビタミンA誘導体（レチノイド）は視力1,2と胚の発生過程および成体組織3-6の遺伝子発現とタンパク質翻訳の調節のための光センシングなど多様な生化学的および細胞イベントに参加しています。レチノールは全身に拡散する能力を持っていますが、進化論は血漿レチノール結合蛋白質、ビタミン、高効率と特異性を達成し、7月10日ランダム拡散に関連する毒性を避けるために、血液中の輸送のための特定のキャリアタンパク質を思い付いた。 RBPに結合し、ビタミンを占める高親和性受容体は、1970 11月13日に仮定された。 RBP受容体14から31の存在に30年間で蓄積された証拠があるにもかかわらず、受容体仮説が原因existencに長年にわたり議論されたホロRBPの間違った定義のe。ホロRBPの正しい定義は、それがレチノールおよびRBPとの間に高い親和性1:1複合体であるということです。有機溶媒によるホロRBPの繰り返し抽出がアポRBPを生成する必要がある。この定義は、RBP 7,9,32-35またはRBP受容体14-31,36-42を勉強し 、ほぼすべてのラボで使用されます。 RBP受容体の存在を反証するために使用されたホロRBPの誤った定義がアポRBPとの自由レチノールの急性混合物である。ビタミンにおけるRBP受容体の機能ホロRBPから取り込みはホロRBPからレチノールを解放することであるので、レチノールが（ホロの間違った定義によって提案で始まって自由である場合には、RBP受容体はレチノール取り込みに何の役割も果たしていないでしょう-RBP）。
ホロRBPで36から43から取り込みが強く、RBPがないという仮説に対して主張している最近のSTRA636呼ばmultitransmembraneドメインタンパク質としてRBP受容体の同定とビタミンにおけるその機能STRA6は、N末端 細胞外に位置しており、細胞内に位置する40 C-末端の9の膜貫通ドメインを有することが明らかになったビタミンAの詳細な分析を提供するために受容体を必要としています。貫 通6と7の間に位置することが不可欠RBP結合ドメイン39です。 STRA6がLRATとビタミンでCRBP-IホロRBPから取り込みの両方に結合されたが、どちらもLRATさCRBP-Iは絶対に強化された41 STRA6活動のために必要です。ホロRBPからレチノールの放出を触媒するSTRA6の能力は、そのビタミン取り込み活性41への鍵となります。そのレチノールを解放するSTRA6に頼ることによって、ビタミンRBPによる配達は、ビタミン、高い特異性と効率性末梢組織中の細胞をターゲットに転送することができます。
ホロRBPの定義と準備が非常に重要であることは、RBP受容体の存在に関する歴史的論争ではなく、ホロRBP定義差に基づいて、3つの関連する最近の論文だけでなく示されているオリジナルと正しい定義44から46からferent。最初の論文は、RBP受容体44を勉強するRBP受容体の存在を不承認とするために使用されたホロRBPの定義を使用していました。 2番目と3番目の論文は、RBP 45,46との適切な複合体を形成するために検討すべきことがあっても可能性が低いレチノールのために作らホロRBPの3番目の定義を思い付いた。これらの研究は、3 H-レチノールとホロRBPを（なくてもアポRBP）混合することにより、3 H-retinol/RBPを用意しました。このアッセイは3 H-retinol/RBPが形成され、過度の自由、3 H-レチノール45,46を削除しなかった持っていなかったので、3 H-retinol/RBPから3 H-レチノール取り込みのためのアッセイではありませんが、無料です3 H-レチノール拡散アッセイ。それはSTRA6がLRAT 38またはCRBP-Iの41でフリーレチノールの細胞への取り込みを増強しないことが以前に示されている。事実上すべてのレチノールは、血液中のRBPに結合され、検出可能な周波数がありません電子レチノール。 RBP受容体の主な機能は、ホロRBP 41からレチノール取り込み時にホロRBPからレチノール放出を触媒することがあります。レチノールが人為的に放出または45,46で始まるように遊離体であるされている場合は、RBP受容体は必要ありません。正しくホロRBPはRBPの正しい調製を例示する準備に基づくアッセイに比べて自由なレチノール拡散アッセイから得られた劇的に異なった結果は、その機能アッセイするために重要です。
RBPは、ヒト血清41から精製され、手順が複雑であり、収率が低いことができます。別のアプローチは、EにRBPを生成することです大腸菌。ため、E.大腸菌が正しくRBPようなジスルフィド結合の複数のペアで哺乳類の分泌タンパク質をフォールドする能力を持っていない、それがフォールディングRBP、正しく折り畳まれたタンパク質を精製するために不可欠です。ミスフォールドタンパク質は、様々なアッセイに折り畳まれたRBPを訂正とは異なる動作をするだけでなく、だけでなく、貯蔵中のタンパク質凝集を引き起こす。同じ理由で、アポRBPは、高品質のホロRBPから生産されています。我々はここで細菌発現、フォールディング、及びHPLC精製を通じてレチノールでロード高品質RBP 100％を生成する最適化されたプロトコルを記述します。 HPLC精製は、誤って折り畳まれたRBPはなく、RBPはシグナル伝達アッセイで使用されている場合、重大なアーチファクトを引き起こす可能性があります重要な細菌汚染を除去するだけでなく。またSTRA6によってレチノール輸送を研究するには、2つの敏感なリアルタイム監視手法について説明します。両方の技術は、高品質のRBPによって異なります。スペースの制限のため、放射性レチノイドベースおよびHPLCベースのビタミンの古典的な技法は取り込みアッセイは、ここでは説明しません。
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Protocol
1。ホロRBPの生産、リフォールディングし、HPLC精製
- pET3aベクトルがN末端に6×Hisタグを有するヒトRBPのcDNAを保有するとともに、BL-21cellsを変換します。 600 nmでのODまでカルベニシリンと40mlのLB培地で37℃で振とう機における形質転換BL-21細胞を成長させるには0.5に達する。 1mMとなるようにIPTGを添加し、RBPタンパク質の発現を誘導する。 37℃で細菌を培養℃でさらに5時間。
- 大腸菌で生産RBPは不溶性の封入体中にほとんど存在しています。 20分間、10,000×gで封入体、細胞をペレット化を豊かにする。その後、凍結融解を2サイクルに続いて、プロテアーゼ阻害剤で5mlのPBSで細胞を氷上で超音波洗浄します。ダウンしてペレットを4℃で30分間20,000 xgで封入体℃、上清を除去し、氷の上にペレットを保つ。
- 10ミリリットル7.5 M塩酸グアニジンで超音波処理し、封入体ペレットを可溶化する。最後のcに25mMトリス緩衝液、pH 9.0およびDTTの半量（5ミリリットル）を追加10mMのoncentration。精力的に完全に削減し、タンパク質を変性させ一晩室温でボルテックスミキサーで溶液を混合。
- 4℃で20分間18000×gで不溶性物質を除去したタンパク質溶液を遠心スピンした後、上清を新しいチューブに移し、チューブを氷上に置きます。
- リフォールディング緩衝液の4倍量（60ミリリットル）を（25 mMトリス、pH 9.0、0.3 mMのシスチン、3.0 mMのシステイン、1mM EDTA）を準備します。ドガリフォールディングバッファー。また薄暗い赤い光の下でエタノールに600μlの10 mMのレチノールを準備します。氷上で暗所に保管しておいてください。リフォールディング緩衝液およびレチノールソリューションの両方が新たに調製する必要があります。
- タンパク質溶液と、少なくとも30分間氷上でリフォールディングバッファーの両方を冷却する。温度が高いと思わリフォールドRBPの品質を低下させる。タンパク質溶液を激しく氷上ビーカー内で混合している間に順番に1 mlのリフォールディングバッファーを滴下し、10μlのレチノールソリューションを追加します。すべてのリフォールディングバッファーまで、この手順を繰り返しますとレチノール追加されます。 5時間、暗所で氷上で反応を攪拌しておいてください。
- 4℃で30分間24000×gでリフォールディング反応をスピンダウンそれは右のフォールディング反応の後に凝集物を除去することが不可欠である。
- 約10mlまでアミコンウルトラ15コンセントレータ（MWCO 10 K）を使用して、上澄み液を濃縮する。このレベル以上のリフォールディング溶液を濃縮しないでください。あまりにも集中させるタンパク質凝集につながり、正しく折り畳まRBPの最終収量や品質を低下させます。冷PBSで100mlに濃縮したサンプルを希釈します。このステップの目的は、ニッケル精製を妨害フォールディング反応のコンポーネントを削除することです。
- 4℃で20分間24000×gでソリューションを1つのより多くの時間を紡ぐこれは、任意の沈殿物を除去することが重要です。 2つの50 mlチューブに、PBSで洗浄されている各含む1mlのNi-NTAスラリーに上清を移してください。 1時間4℃でチューブを回転させます。希釈液fをインキュベートまたは1時間を削除する必要がミスフォールドタンパク質の沈殿を生じることがあります。
- 3分間、500×gでチューブをスピンダウンします。慎重に上清を除去します。フローティング何も削除する必要があります。各チューブに30 mlに冷PBSを追加します。再びスピンし、上清を除去します。あなたはチューブではなく、ビーズ何も見えなくなるまで、このプロセスを繰り返します。
- 空の列にNi-NTA樹脂を転送します。 10mMイミダゾール、PBS中500mMのNaClの20カラム体積で樹脂を洗浄します。 PBS中100mMイミダゾールを5カラム容量におけるHis-RBPを溶出する。長時間、このソリューションを保存し、凍結は最終収量と品質を削減しないでください。最良の結果のために、直ちにHPLCによりRBPを清める。
- 25 mMトリス、pH 8.4、120 mMのNaClに対するNi-NTA樹脂から精製したHis-RBPを透析する。コンセントレータは、バッファの交換のために使用することができます。 °Cの右各実行の前に4℃で10分間16000×gで遠心分離によるHPLC用のクリアサンプル。
- イオンを用いたHPLCでホロRBPを清める交換カラムに1ml /分で移動相として25 mMトリス、pH 8.4を用いてNaClの段階的勾配（220 mMの12分、360 mMの15分であり、1,000 mmの15分）で、AX-300。 NaCl濃度が上昇すると、ホロのHis-RBPはアポRBPながら解放され、RBPがカラム（ 図1）に結合した滞在ミスフォールドされています。 RBPのリフォールディングが最適に行われていない場合、RBP（ 例えば、 図1 に RBP-Iをミスフォールド）製剤全体を風靡することができミスフォール。
- 360 mMのNaClのピーク画分から正しく折り畳まれたホロRBPを回復します。慎重に正しく折り畳まれたHis-RBPミスフォールドの溶出プロファイルを監視します。 1000℃のNaCl、ほとんどのは、His-RBPが解放されるべきミスフォール。
- ホロRBPを含む画分をプールし、濃縮し、4℃で一晩、PBSに対して透析する分光光度計による最終的な収量と品質（330 nm/280 nm）を確認してください。正しく折り畳まれた製品には、1（図 1）よりも若干高いの330 nm/280 nmの比を持っている必要があります。
- 生産へ電子アポRBPは、精製されたホロRBPにヘプタンの等量を追加し、4℃で一晩回転させることにより穏やかに混合4℃で10分間16,000 gで遠心し、注意深く新しいチューブ（インターフェイスで沈殿を避ける）に底水相を転送します。各3時間のインキュベーションを使用してプロセスを3回繰り返します。 330 nmのピークがバックグラウンドレベルまで減少していることを確認するためのナノドロップ分光光度計の吸収を確認してください。
2。 STRA6触媒によるレチノールリリースおよびレチノール読み込みのリアルタイム監視
- 一晩ブロッカーカゼイン（Pierce）を200μlで黒96ウェルMicrofluor-2プレート（サーモサイエンティフィック）4℃プラスチックにホロRBPの非特異的付着を防止するためにブロックします。ブロッカーカゼインは、我々がテストしたすべてのブロッキングソリューションの最良のブロッキング効果を与えます。
- たてSTRA6またはコントロール細胞を発現する細胞から調製した膜は、PBSを用いて洗浄し、ハミルトンシリンジ（Gasti通されるGHT＃1710）をPBSで均一な懸濁液を生成するために6回。我々は通常、反応あたり100 mmディッシュで培養した細胞の1/100〜1/20〜由来の膜を使用しています。
- 200μlのPBSで一回Microfluor-2プレートのコーティングしたウェルを洗浄します。膜懸濁液（ウェルあたり50μl）を添加する前に、氷の上でプレートを冷却する。
- レチノール蛍光のリアルタイムモニタリングは、励起フィルタ320EX及びエミッションフィルタ460から10とPOLARstarオメガ（BMG LABTECH）の蛍光光学系を用いて測定される。プログラムは、エンドポイントの読み取りモードに設定されています。平板モードも時間間隔を変化させていない場合、時間経過を測定するために使用することができます。各時点からの信号は、10回の測定（2ミリメートルの直径を持つ軌道平均）の平均値であり、ゲインは1800に設定されています。プレートは、各測定の前に二重軌道振とうを使用して500rpmで10秒間振とうする。
- レチノール放出アッセイを開始するには、井戸がメートルを読んでエンドポイントを使用して1度読まれるホロRBP前頌歌（典型的には、1μMの最終濃度）0分に追加されます。ホロRBPが追加されるとすぐに、反応は1-3時間、連続して5〜10分毎に監視されています。レチノールローディングアッセイを開始するには、オールトランスレチノール（典型的には、1μMの最終濃度）の薄暗い赤い光の下でウェルに添加する。アポRBPを0分に追加される前にプレートが一度読み取られます。アポRBPが追加されるとすぐに、反応は1-3時間、連続して5〜10分毎に監視されています。
- すべての測定が完了したら、データ分析のためのMicrosoft Excelへのオメガのデータ解析ソフトウェア（BMG LABTECH）からの生データ（ 図2の例）をダウンロードしてください。それぞれの時点では、すべての実験条件の測定値を含むファイルを生成します。 20時間ポイントがある場合は、データ分析のための1つのExcelファイルに20個のファイルを統合します。
- データ分析は、0分でレチノールまたはホロRBPの添加前蛍光シグナルは、バックグラウンドシグナルを考えられているdはすべての時点で最終蛍光信号から減算。バックグラウンド信号を低減算、ホロRBPでレチノール蛍光と比較されますが、背景には膜による光散乱の非特異的な影響を排除し、それが0分で追加されたホロRBPまたはレチノールレチノール蛍光に集中することが可能になります。
3。 CRBP-IにホロRBP-レチノールからのSTRA6触媒による輸送のリアルタイム監視
- レチノール-EGFPは、最近41確立された新しい蛍光共鳴転移（FRET）のペアです。ホロRBPからEGFP-CRBP-Iはレチノール-EGFPを測定することにより、リアルタイムでモニターされているにSTRA6触媒によるレチノール輸送はFRET。 6xHisタグ（EGFP-CRBP-I）とEGFP-CRBP-I融合タンパク質は、哺乳動物細胞で産生されており、実験の前にNi-NTA樹脂で精製する。 EGFP-CRBP-Iは4℃で短時間のプロテアーゼ阻害剤を含むPBSに格納することができますあるいは、融合タンパク質Isは-80℃·小アリコートで凍結した。
- 上記のように反応する前に、ブロックされMicrofluor-2プレートと膜を調製する。膜懸濁液（ウェルあたり50μl）を添加する前に、200μlのPBSで一度Microfluor-2プレートのコーティングしたウェルを洗浄します。
- リアルタイムレチノール-EGFP FRETは、励起フィルタ320EXと同時決闘放射蛍光光学系を用いた発光フィルター460から10と510から10とPOLARstarオメガを使用して測定される。プログラムは、エンドポイントの読み取りモードに設定されています。平板モードも時間間隔を変化させていない場合、時間経過を測定するために使用することができます。各時点からの信号は、10回の測定（2ミリメートルの直径を持つ軌道平均）の平均値であり、利得はチャネルあたり1800に設定されています。プレートは、各測定の前に二重軌道振とうを使用して500rpmで10秒間振とうする。
- 反応を開始するには、EGFP-CRBP-I（通常は、1μMの最終濃度）をウェルに添加する。プレート上に読み込まれホロRBP前にエンドポイントの読み取りモードを使用してCEは0分に追加されます。ホロRBPが追加されるとすぐに、この反応は、測定により連続的に1〜2時間ごとに5〜10分を監視されています。
- すべての測定が終了したら、上記のようなデータ分析のためのオメガのデータ解析ソフトウェアからMicrosoft Excelへの生データ（ 図3に示す例）をダウンロードしてください。
- レチノール-EGFPは、アクセプター/ドナー発光ピーク47の比率のダイナミックな変化によって計算されるFRET。この比率を計算するための式（41）は [（510 トン -510 B）/（460トン -460 b）]を、ここで510 トン 、510 B、460トン 、460 bは反応開始後510 nmでの排出量を表す（ t =時間ポイント）は、レチノールまたはホロRBP前510nmで反応（T =時点）開始後の460nmで、（B =バックグラウンド）を加え、レチノールまたはホロRBP前460nmで追加されます（B =バックグラウンド）であった。
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Representative Results
我々は、HPLC（ 図1）、アポRBP（ 図2）とのリアルタイム分析にホロRBP及びレチノールのローディングからSTRA6触媒によるレチノールリリースをリアルタイムで分析することによりここにホロRBPの生産および精製の ための代表的な結果を提示ホロRBPからEGFP-CRBP-IへSTRA6触媒によるレチノール輸送（ 図3）。
リフォールディングすることなく、細菌で産RBPはほぼ完全に多くの誤ったジスルフィド結合の存在に起因するミスフォールドされています。したがって、リガンドレチノールの存在下でリフォールディングすると、よく折られたRBPを得ることに非常に重要である。私たちは、リフォールディング反応が正しく行われていない場合は、RBP種（ 例えば、 図1 に RBP-Iをミスフォールド）製剤全体とホロRBPは、HPLC精製後に非常に低くすることができ、高品質の収量を風靡することができミスフォールことがわかった。したがって、HPLCは貧しいフォールディングの問題を解決することはできません。に示すように
一度に利用できる高品質ホロRBPまたはアポRBPの精製された、それはSTRA6触媒によるレチノール輸送を研究するために使用することができます。リアルタイムレチノール放出アッセイおよびレチノールローディングアッセイの両方がレチノール蛍光をモニターすることに依存しています。レチノール蛍光の人工的な衰退原因の一つは、プラスチック製の皿（RBPはプラスチック壁に結合されると、それはもはや溶液中で測定することはできません）へのRBPの非特異的な結合である。我々は、多くのブロッキング状態をテストし、ブロッカーカゼイン（ピアース）はレチノール蛍光のこの非特異的および受容体非依存性の減少を減らすのに最も効果的であることを発見した。説明したようにレチノール蛍光の人工減少のもう一つのソースは、RBPの質が悪いです上記の。
図2および図3の代表的なデータで示されているようにSTRA6触媒によるレチノールリリース、レチノールローディングおよびレチノール輸送は、比較的遅いイベントです。各RBPだけビタミンAの1分子を結合するので、反応は比較的遅く、すべてSTRA6触媒反応は継続し、RBPの結合と解離RBPの両方に依存します。 STRA6触媒によるレチノール放出反応を継続するには、ホロRBPは唯一アポRBP解離後にバインドすることができます。継続するSTRA6触媒によるレチノールローディング反応のために、アポRBPは唯一ホロRBPが解離した後にバインドすることができます。ここで説明するすべてのリアルタイムモニタリング技術に関しては、計測の理想的な周波数は、一回の測定ごとに5分または10分であることがわかった。より頻繁な測定は、より高い時間分解能を作成することもできますが、各時点でExcelファイルを作成するので、結果のデータファイルは非常に大きくなります。
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図1：精製レチノールでロードホロRBP 100％を取得するためにHPLCでRBPリフォールディング。ニッケル樹脂精製は、RBPはNaCl段階勾配（220 mMの10分、360 mMの15分であり、1,000 mmの15分間）によってイオン交換カラムのAX-300に印加されるリフォールディング。正しく折り畳まれたホロのHis-RBPは解放され、360nmのNaClで溶出させる。正しく折り畳まれたホロRBPに対応するピークの吸収スペクトル（250nmの波長400nm）は、RBP-1ミスフォールドRBP-2ミスフォールド、汚染も（タンパク質ピークが青い縦線で示され、レチノールピークが示されている示されてい赤の縦線を引いて）。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2：アポRBPとホロRBPからレチノールリリースにSTRA6触媒によるレチノール負荷をリアルタイムで監視。このアッセイはSTRA6がLRATまたはCRBP-IAオメガデータ解析ソフトウェアに示されているようにSTRA6-catalzyedレチノールレチノールローディングとリリースのための生データファイルの例をせずに単独で何ができるかを明らかにする上で重要な役割を果たした。レチノール放出反応を開始するには、ホロRBPはSTRA6膜または制御0分で膜に添加されています。レチノールローディング反応を開始するには、レチノールは0分でアポRBPと予混合STRA6膜または膜コントロールに追加されます。 320 nm励起と460 nm発光の蛍光測定は、反応の時間的経過を明らかにした。アポRBP（; 2,4、および6は、制御反応で1,3、および5はSTRA6反応である）への反応は1から6までモニターレチノールローディング。反応7から12モニターレチノールアポRBPにローディング（7,9、および11はSTRA6反応であり、8,10、および12は、制御反応である）。 BのAに示すように、左のグラフは、6への反応1に基づいて計算された反応のための最終的な計算された信号。右のグラフは反応12から7に基づいて算出した。最高の蛍光シグナルは左のグラフの1として定義されています。 0分で追加されたホロRBPの蛍光は、右のグラフの1として定義されています拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3ホロRBPからCRBP-IAにSTRA6触媒によるレチノール輸送のリアルタイム監視オメガデータ解析ソフトウェアに示されているように、レチノールとEGFPとの間のFRET監視生データファイルの例。 0分で、ホロRBPはとSTRA6膜（反応1、3、5）または制御膜を含有する反応物に添加されたEGFP-CRBP-私が反応（反応2、4、6）を開始します。 320 nmでの励起のための同時決闘エミッション測定では、460から10発光時間コースと510から10発光時間コースとして青のトレースのように緑のトレースを明らかにした。 B.計算された最終のAに示すように反応するための信号をFRET FRETシグナルは、ステップ3.6の方法に従って算出した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
RBPの生産および精製手順が正しく折り畳まれたRBPを生成するために重要ですので、我々はここで最適化されたRBP生産プロトコルを共有しています。ミスフォールドRBP種の可能性、さらにはHPLC精製細菌生産RBP内細菌タンパク質の微量の存在を考えると、それは、RBPに関連した結論を確認するために血清からネイティブRBPを使用すると便利です。市販されている尿中RBPは、アポRBPとホロRBP 48,49含むRBPの多くの種の複雑な混合物である。
ここで説明するリアルタイム·モニタリング技術はレチノールの固有蛍光に基づいています。これらのアッセイを開発するためのオリジナルの弾みは、我々は古典的な放射性アッセイおよびHPLCベースアッセイによって明らかにすることができる情報が限られていたということでした。例えば、私たちはSTRA6少しビタミンAビタミン取り込みアッセイで単独で取り込み活性を有することを見出したが、我々は簡単にSの低活性を説明することはできませんビタミンでTRA6 LRATまたはCRBP-Iの41せず取り込み。レチニルエステルベースのアッセイでは、それはSTRA6がLRAT活性を有する酵素ではないので、それ自体でSTRA6はレチニルエステルをなさないことを理解することは容易である。しかし、レチノールベースのアッセイにおいて、STRA6はまだそれ自体ではほとんど活性を有する。 STRA6はまったくビタミン取り込み活性を持っていますか？そうでない場合、どのようにCRBP-IまたはLRATは、その活動を加速させることができますか？それがない場合は、なぜそれがCRBP-IまたはLRATが必要なのですか？放射性アッセイおよびHPLCベースアッセイは、これらの質問には答えなかったが、我々はSTRA6はRBPからレチノールを放出する能力を持つべきであると推論した。我々はまた、レチノール蛍光アッセイは、この活動を明らかにするかもしれないと推論した。レチノール蛍光測定により、光がリアルタイム50,51で視覚色素の漂白後脊椎動物視細胞におけるフリーレチノールの動きを勉強してきました。どのようにRBP受容体活性は、レチノール蛍光を測定することによりモニターすることができますか？それは年に発見されたRBPは52,53に結合した場合レチノールが劇的蛍光を強化したことを二つの研究グループによって、1970年代初頭。我々は、アポRBPにSTRA6触媒によるレチノール負荷がレチノール蛍光の増加を引き起こしながら、ホロRBPからSTRA6触媒によるレチノールリリースは、レチノール蛍光の減少を引き起こすことがわかった。放射性アッセイおよびHPLCベースアッセイはビタミン摂取を研究するために広く使用されてきたが、受容体の供給源として使用内因性膜は非常に高いバックグラウンド蛍光を持っているので、蛍光アッセイはおそらく、最近までRBP受容体活性を研究するために使用されていませんでしたそれが困難な各タンパク質の寄与を解釈できるようになりレチノイド結合タンパク質/酵素の複雑な混合物を持っています。現在利用可能な精密機器は、これらの技術は、より実現可能なものもあります。直接蛍光測定に加えて、新しいレチノール-EGFPは、対41を FRET同時決闘排出光学系と相まってそれが可能リアルタイムで、同時に複数の反応におけるレチノール結合タンパク質にレチノール輸送を研究することができます。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
健康助成R01EY018144の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| guanidine hydrochloride | EMD | 5010 | |
| cystine | Sigma | C8755 | |
| cysteine | Sigma | C7352 | |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | |
| Tris | Fisher | 7786-1 | |
| DTT | EMD | 3860 | |
| retinol | Sigma | R7632 | |
| carbenicillin | Fisher | BP2648-5 | |
| IPTG | EMD | 5810 | |
| PBS | EMD | 6508 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
| imidazole | EMD | 5720 | |
| heptane | EMD | HX0295-1 | |
| Blocker Casein | Pierce | 37528 | |
| Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) | Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor-2 plate | Fisher | 14-245-177 | |
| Hamilton syringe Gastight #1710 | Fisher | 14-824-655 |
References
- Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R.
- Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
- Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
- Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
- Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R.
- Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
- Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
- Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
- Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
- Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
- Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
- Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
- Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
- Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A.
- Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
- Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
- Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
- Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
- Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
- Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
- Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
- Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
- Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
- Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
- Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
- Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
- Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
- Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
- Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
- Rask, L., et al.
- Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
- Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
- Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
- Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
- Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
- Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
- Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
- Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
- Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
- Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
- Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
- Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
- Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
- Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
- Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
- Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
- Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).
