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Immunology and Infection

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l'effetto dell'infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Published: August 9, 2013 doi: 10.3791/50809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

Summary

Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.

Abstract

Molti virus a RNA sono evoluti la capacità di inibire la trascrizione cellula ospite come mezzo per aggirare difese cellulari. Per lo studio di questi virus, è quindi importante avere un modo rapido e affidabile di misurazione dell'attività trascrizionale nelle cellule infette. Tradizionalmente, la trascrizione è stata misurata mediante incorporazione di nucleotidi radioattivi come 3 H-uridina seguita da rilevamento mediante autoradiografia o conteggio a scintillazione, o incorporazione di uridina analoghi alogenati come il 5-bromouridine (BRU), seguita da rilevamento mediante immunoistochimica. L'uso di isotopi radioattivi, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e non è praticabile in una serie di impostazioni di laboratorio, mentre il rilevamento di Bru può essere ingombrante e può soffrire di bassa sensibilità.

La chimica click recentemente sviluppato, che comporta una formazione triazolo rame-catalizzata da una azide e un alchino, fornisce ora una rapida e highly alternativa sensibili a questi due metodi. Clicca chimica è un processo in due fasi, in cui l'RNA nascente è prima etichettato per incorporazione di uridina analogico 5 ethynyluridine (UE), seguita dalla rilevazione del marchio con una azide fluorescente. Questi azidi sono disponibili come diversi fluorofori differenti, permettendo una vasta gamma di opzioni per la visualizzazione.

Questo protocollo descrive un metodo per misurare la soppressione trascrizionale in cellule infettate con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12 utilizzando clic chimica. Contemporaneamente, espressione di proteine ​​virali in queste cellule è determinata dalla classica immunocolorazione intracellulare. Passaggi da 1 a 4 dettaglio un metodo per visualizzare la soppressione trascrizionale tramite microscopia a fluorescenza, mentre i passaggi da 5 a 8 dettaglio un metodo per quantificare la soppressione trascrizionale tramite citometria a flusso. Questo protocollo è facilmente adattabile per l'uso con altri virus.

Introduction

Tradizionalmente, l'attività trascrizionale è stata misurata attraverso l'inserimento di una radioattivo (3 H-uridina) 1 o alogenati (BRU) 2 nucleosidi in RNA nascenti. Questi analoghi uridina vengono assorbiti dalle cellule, convertiti in uridina-trifosfato (UTP) attraverso la via di recupero nucleoside, e successivamente incorporate nella nuova sintesi dell'RNA. 3 H-uridina possono essere rilevati mediante autoradiografia, che può richiedere molto tempo, o scintillazione conteggio, che richiede attrezzature specializzate. Inoltre, l'uso di isotopi radioattivi non può essere pratico in una serie di impostazioni di laboratorio, compresa alto contenimento laboratori di biosicurezza. Bru può essere rilevato attraverso immunoistochimica con anticorpi anti-BRU, che possono richiedere dura permeabilizzazione per garantire l'accesso degli anticorpi al nucleo o parziale denaturazione di RNA, come struttura secondaria dell'RNA potrebbe essere un impedimento sterico il legame degli anticorpi.

_content "> Il protocollo qui descritto utilizza la chimica Clicca recentemente sviluppato clicca chimica 3 per misurare l'attività trascrizionale in cellule infettate con il ceppo RVFV MP-12. basa su un rame altamente selettivo ed efficace (I)-catalizzata reazione di cicloaddizione tra un alchino e una porzione azide 4,5. In questo protocollo, nascenti RNA nelle cellule infettate viene prima etichettato mediante incorporazione della uridina analogico UE. In una seconda fase, l'UE incorporato viene rilevato mediante reazione con un azide fluorescente. I principali vantaggi di questo metodo sono (1) che non richiede l'uso di isotopi radioattivi e (2) che non richiede aspro permeabilizzazione o denaturazione di RNA. Con un peso molecolare inferiore a 50 Da, accesso del azide fluorescente non impedito da insufficiente permeabilizzazione o RNA struttura secondaria. Inoltre, i ricercatori non sono limitati nella loro scelta di anticorpi primari quando si associa la rilevazione di RNA con una classeimmunoistochimica iCal per le proteine ​​virali.

Due diversi metodi sono descritti in questo protocollo: uno per la visualizzazione di trascrizione mediante microscopia a fluorescenza (punti 1-4), e uno per quantificare la trascrizione attraverso citometria a flusso (passi 5-8). Entrambi questi metodi si combinano etichettatura di RNA nascenti con una immunocolorazione intracellulare di proteine ​​virali, che consente una correlazione tra l'attività trascrizionale e l'infezione virale su base cella per cella.

Gli autori hanno utilizzato con successo il protocollo qui descritto per determinare l'attività trascrizionale in cellule infettate con il ceppo RVFV MP-12 6 cellule infettate con differenti MP-12 mutanti 7,8, 9 e cellule infettate con virus Toscana (TOSV) 10. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per l'uso con diversi virus ed ha il potenziale di essere modificato per includere immunofluorescenza di proteine ​​virali o cellulari specifici.

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Protocol

Analisi della trascrizione mediante microscopia a fluorescenza

1. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE

  1. Luogo di 12 mm coprioggetto rotondi in 12 pozzetti coltura tissutale, un coprioggetto per pozzetto.

Nota: se le cellule hanno difficoltà aderendo al coprioggetto, cappotto con poli-L-lisina (MW ≥ 70.000) prima di mettere in pozzi. A tale scopo, coprioggetto sommergere in una soluzione sterile 0,1 mg / ml in H 2 O di poli-L-lisina per 5 min. Risciacquare con coprioggetto sterili H 2 O e asciugare per almeno 2 ore.

  1. A seme 293 cellule su vetrini coprioggetto, aggiungere 5 x 10 4 cellule in 1 ml di mezzo di crescita (DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina) per pozzetto. Incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 O / N.
  2. Infettare cellule con MP-12 in una molteplicità di infezione (moi) di 3. Includere almeno due pozzi infetti: uno dei due pozzi servirà come il controllo non infetto, l'altra saranno trattati con actinomicina D (ACTD) al punto 1.5 come controllo per la repressione trascrizionale. Rimuovere mezzo di crescita e diluire il magazzino virus in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto è 200 ml. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2.

Nota: Invece di infettare le cellule, le cellule possono essere trasfettate con DNA plasmidico o sintetizzati in vitro di RNA codificante per una proteina virale specifico. A questo scopo, trasfettare cellule con un appropriato reagente di trasfezione chimica secondo le istruzioni del fabbricante e procedere al punto 1.5 a 16 ore dopo la trasfezione. Si consiglia di ottimizzare le condizioni di trasfezione e il tempo di incubazione prima dell'etichettatura RNA e fissazione.

  1. Rimuovere inoculo e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 15 ore.
ove_content ">. Nota: Se adattare questo protocollo per l'uso con un altro virus, si consiglia di eseguire un esperimento corso del tempo per determinare il punto di tempo ottimale per l'etichettatura di RNA e la fissazione Impostare questa volta ovviamente in modo che i tempi di infezione sono sfalsati e tutti campioni possono essere etichettati, fissate e colorate allo stesso tempo.

  1. A 15 ore dopo l'infezione (HPI), sostituire il terreno di coltura con terreno contenente 1 mM UE. Per uno dei pozzi infetti finti, aggiungere anche 5 mcg / ml ACTD. Questo servirà come controllo per la repressione trascrizionale, come ACTD inibisce la sintesi di RNA DNA-dipendente. Cellule Rientro in incubatrice.
  2. Al 16 HPI, rimuovere il terreno e lavare i coprioggetti una volta con 1 ml di PBS (KCl 0,20 g / l, KH 2 PO 4 0.20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1.15 g / L, pH 7,4) per pozzetto. Fix cellule aggiungendo 1 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT.

Nota: Per preparare la soluzione di fissaggio 4% PFA, sciogliere 10 g di paraformaldeide in 150 ml di H 2 O riscaldata a 60 ° C su un agitatore magnetico riscaldato. Aggiungere 500 ml di NaOH 1M e continuare a mescolare fino a quando la soluzione diventa chiara. Filtro soluzione PFA attraverso una carta da filtro per rimuovere le particelle e aggiungere 62,5 ml di tampone fosfato (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7.4). Aggiungere H 2 O fino ad un volume totale di 250 ml. Congelare a -20 ° C in aliquote monouso.

  1. Lavare una volta con 1 ml di PBS per pozzetto. Non è richiesto alcun tempo di incubazione per questa e tutte le successive fasi di lavaggio. Procedere immediatamente alla fase 2.

Nota: è importante procedere immediatamente con la reazione scatto, come l'RNA degenera se conservate a questo stadio per periodi di tempo prolungati, una perdita del segnale di fluorescenza RNA è già emersa se ​​le cellule sono conservate per 1 ora a 4 ° C . Allo stesso modo, se performando un esperimento corso di tempo, essere sicuri di etichetta, correggere e macchia tutti i campioni contemporaneamente.

2. Clicca Reazione a rilevare RNA marcate

  1. Permeabilize cellule aggiungendo 1 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubare per 10 min a RT.

Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in passaggi da 2.1 a 2.3 devono essere nucleasi libero.

  1. Lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto.
  2. Togliere i coprioggetti da 12-pozzetti e trasferimento in camera umida. Coprire ogni vetrino con 50-100 soluzione colorante click microlitri (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 20 mM azide fluorescente [eccitazione / emissione massima: 590/617 nm], 100 mM di acido ascorbico) ciascuna. Incubare per 1 ora a RT al buio.

Nota: Per assemblare la camera umida, linea di fondo di una coltura cellulare o capsula di Petri con un diametro di 10 cm con una pellicola di plastica paraffina. Rivestire l'interno del bordo del dish con tovaglioli di carta umidi. Posizionare il coprioggetto sulla pellicola di plastica paraffina.

Nota: Fare attenzione a non lasciare che i coprioggetti asciugare nel corso di questo o di qualsiasi altro passo nel protocollo. È consigliabile aggiungere la soluzione di colorazione per ciascun coprioggetto direttamente dopo che è stato collocato nella camera umida.

Nota: Preparare la soluzione colorante click fresco immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di 1,5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO 4, e 500 mM di acido ascorbico possono essere conservati a 4 ° C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione madre di acido ascorbico che ha trasformato giallo.

Nota: Assicurarsi di selezionare un fluoroforo che corrisponde ai filtri il microscopio a fluorescenza.

  1. Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto in un fresco 12-pozzetti e lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto.

Nota: se non deprotezione di proteine ​​virali è desiderato, coprioggetto può essere montato e ripreso dopo questo passaggio (passare al punto 3.3).

3. Immunofluorescenza per rilevare l'espressione di proteine ​​virali

  1. Aggiungere 1 ml di tampone di bloccaggio (3% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) in PBS) a ciascun pozzetto ed incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
  2. Togliere i coprioggetti da 12-pozzetti, trasferimento in camera umida e coprire con 50-100 ml di anticorpo primario (anti-RVFV, un gentile dono del Dr. RB Tesh, UTMB) diluito in tampone di bloccaggio (1:500). Incubare per 1 ora a RT al buio.

Nota: Quando adattare questo protocollo per l'utilizzo con un virus diverso, determinare la diluizione ottimale per il primo anticorpo primario.

Nota: In alternativa, questa fase può essere realizzata O / N a 4 ° C al buio.

  1. Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto di nuovo in 12-pozzetti e lavaretre volte con 1 ml di PBS per pozzetto.
  2. Rimuovere coprioggetto da posto 12-bene, posto in camera umida e coprire con 50-100 ml di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [eccitazione / emissione massima: 495/519 nm]) diluito in tampone di bloccaggio (1: 500). Incubare per 1 ora a RT al buio.

Nota: Assicurarsi di selezionare un anticorpo secondario in grado di riconoscere il vostro anticorpo primario e corrisponde ai filtri il microscopio a fluorescenza.

Nota: Se si desidera, 200 ng / ml DAPI può essere aggiunto alla diluizione anticorpo secondario per visualizzarne nuclei.

  1. Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto di nuovo in 12-pozzetti e lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto.
  2. Montare coprioggetto mettendo una goccia (ca. 15 ml) di Fluoromount-G su un vetrino da microscopio. Immergere il vetrino in H 2 O, eliminare l'eccesso di H 2 O toccando thlato e contro un tovagliolo di carta, e posto cellula-lato giù nella goccia di Fluoromount-G. Aria secca per 5 min.

Nota: Se l'imaging su un microscopio invertito, consentire Fluoromount-G a solidificare a 4 ° CO / N o apporre il coprioggetto al vetrino sigillando il bordo con smalto trasparente.

Nota: Le diapositive possono essere ripreso immediatamente o conservati a 4 ° C al buio per un massimo di una settimana.

4. Acquisizione di dati

  1. Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Nota: Assicurarsi di selezionare fluorofori adeguati che possono essere visualizzati utilizzando il microscopio. Per riferimento, i seguenti sono i fluorofori e set di filtri utilizzati per acquisire le immagini mostrate in questa pubblicazione.

DAPI:
Filtro di eccitazione: BP 330-385
Specchio Dichromatic: 400 DM
Filtro per le emissioni: LP 420

Filtro di eccitazione: BP 460-490
Specchio Dichromatic: 505 DM
Filtro per le emissioni: LP 510

Fluoroforo con eccitazione / emissione massima di 590/617:
Filtro di eccitazione: BP 545-580
Specchio Dichromatic: 600 DM
Filtro per le emissioni: LP 610

Analisi della trascrizione mediante citometria di flusso

5. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE

  1. Seme 293 cellule in 6 pozzetti coltura tissutale nel terreno di coltura (DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina). Incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 finché le cellule hanno raggiunto 80 - 100% di confluenza.
  2. Infettare cellule con MP-12 ad una MOI di 3. Includere almeno due pozzi infetti: uno dei due pozzi servirà come il controllo non infetto, l'altra saranno trattati con ACTD a passo5.4. Rimuovere mezzo di crescita e diluire il magazzino virus in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto è di 400 microlitri. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2.
  3. Rimuovere inoculo e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 12 hr.

Nota: Se adattare questo protocollo per l'uso con un altro virus, si consiglia di eseguire un esperimento corso del tempo per determinare il punto di tempo ottimale per l'etichettatura e la raccolta. Impostare questo tempo corso in modo che i tempi di infezione sono sfalsati e tutti i campioni possono essere etichettati, raccolto, e colorate allo stesso tempo.

  1. Al 12 hpi, sostituire terreno di crescita con terreno contenente 0,5 mM UE. Per uno dei pozzi infetti finti, aggiungere anche 5 mcg / ml ACTD. Questo servirà come controllo per la repressione trascrizionale, come ACTD inibisce la sintesi di RNA DNA-dipendente. Cellule Rientro in incubatrice.
  2. Al 13 hpi, lavare le cellule una volta with PBS e raccolto da tripsinizzazione delle cellule. Lavare le cellule raccolte tre volte con PBS contenente 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

Nota: durante questo e nei successivi passaggi, non centrifugare le cellule più veloce di 500 - 1.000 xg per evitare la rottura delle cellule. Centrifugare le cellule per 1 - 2 minuti per sedimento.

Nota: Se un immunoistochimica superficie è prevista a seguito della reazione di click, raccolto utilizzando un poliziotto in gomma o un raschietto cellulare usa e getta, invece.

  1. Fissare le cellule da essi risospendere in 1 ml di PFA 4% e incubare per 30 minuti a RT. Fare riferimento al punto 1.6 per le istruzioni su come preparare 4% PFA.
  2. Lavare una volta con 1 ml di PBS-EDTA per pozzetto. Procedere immediatamente alla fase 6.

Nota: è importante procedere immediatamente con la reazione scatto, come l'RNA degenera se conservate a questo stadio per periodi di tempo prolungati. Analogamente, se l'esecuzione di un tempo cesperimento ourse, assicurati di etichettare, fissare e colorare tutti i campioni contemporaneamente.

6. Clicca Reazione a rilevare RNA marcate

  1. Permeabilize risospendendo cellule in 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubare per 10 min a RT.

Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in passaggi 6,1-6,3 devono essere nucleasi libero.

Nota: Se le cellule non sedimenti correttamente durante questa fase, aumentare il tempo di centrifugazione per 5 min. Comportamento di sedimentazione migliorerà una volta le cellule sono sospese in FACS tampone (passo 6.4).

  1. Lavare una volta con 1 ml di PBS.

Nota: non utilizzare EDTA in questo passaggio come questo chelare il Cu 2 + ioni necessari per la reazione click.

  1. Risospendere le cellule in 200 microlitri soluzione colorante click (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 200Nm azide marcato con colorante fluorescente [excitation / emissione massima: 650/665 nm], 100 mM di acido ascorbico). Incubare per 1 ora a RT al buio.

Nota: Preparare la soluzione colorante click fresco immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di 1,5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO 4, e 500 mM di acido ascorbico possono essere conservati a 4 ° C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione madre di acido ascorbico che ha trasformato giallo.

Nota: se le cellule si aggregano assieme durante questa fase, risospendere pipettando su e giù parecchie volte.

Nota: Assicurarsi di selezionare un fluoroforo che può essere rilevato dal citofluorimetro.

Nota: preparare anche un campione di cellule infette che non sono soggette alla procedura di colorazione click, che saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Usare sia la metà delle cellule infette o includere un ulteriore infettato ben al passo 5.2. Questi concellule trollo saranno immunomacchiate al passo 7.1.

  1. Lavare due volte con tampone FACS (PBS contenente 1 mM EDTA e 0,5% (w / v) BSA).

Nota: Se non si desidera immunoistochimica di proteine ​​virali, le cellule possono essere analizzati immediatamente (passare al punto 8).

7. Immunofluorescenza per rilevare l'espressione di proteine ​​virali

  1. Risospendere le cellule in 200 microlitri di anticorpo primario (anti-RVFV) diluite in FACS tampone (1:10.000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.

Nota: In alternativa, questa fase può essere realizzata O / N a 4 ° C al buio.

Nota: preparare anche un campione di cellule non infette, che sono stati sottoposti alla procedura di colorazione click ma non verrà immunomacchiate, questi saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Usare sia la metà delle cellule infette finti o includono una ben infetto supplementare apunto 5.2.

Nota: Quando adattare questo protocollo per l'utilizzo con un virus diverso, determinare la diluizione ottimale per il primo anticorpo primario.

  1. Lavare le cellule due volte in tampone FACS.
  2. Risospendere le cellule in 200 microlitri di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [eccitazione / emissione massima: 495/519 nm]) diluito in tampone FACS (1:1000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
  3. Lavare le cellule una volta in tampone FACS.

Nota: A questo punto, le cellule possono essere conservate O / N a 4 ° C al buio.

8. Acquisizione di dati

  1. Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer FACS, trasferimento in 5 ml provette di polistirene e analizzare utilizzando un citofluorimetro. Utilizzare MP-12 cellule infette (nessuno scatto di reazione, solo colorazione anti-RVFV) e le cellule infette finte (clicca unica reazione) per calibrare lo strumento.

None: Assicurarsi di selezionare fluorofori adeguati che possono essere rilevati dallo strumento. Per riferimento, le seguenti sono le linee laser e set di filtri usati per acquisire i dati riportati in questa pubblicazione.

Fluoroforo con eccitazione / emissione spettro di 495/519:
Laser: 488 nm
Filtro: 530/30

Fluoroforo con eccitazione / emissione spettro di 650/665:
Laser: 640 nm
Filtro: 670/20

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Representative Results

La proteina di NSS RVFV (famiglia Bunyaviridae, genere Phlebovirus) 11 inibisce la cellula ospite trascrizione generale attraverso due meccanismi distinti: (i) sequestrando la subunità p44 del fattore di trascrizione basale TFIIH 11 e (ii), promuovendo la degradazione proteasoma della p62 subunità di TFIIH 6. Il RVFV MP-12 vaccino ceppo 13 è stato utilizzato per gli esperimenti descritti in questo protocollo da MP-12 ceppo può essere gestita in un livello 2 laboratorio di biosicurezza ed è escluso dalla regola di selezione agente negli Stati Uniti, che si applica alle altre wild- digitare ceppi RVFV. La proteina NSS di MP-12 ceppo è completamente funzionale e mantiene la capacità di sopprimere la trascrizione ospitante 6. Il virus rMP12-C13type, che porta una delezione che comprende il 69% del gene NSS 14, è stato incluso come un virus di controllo privo di tutte le funzioni NSS, tra cui la capacità di sopprimere la trascrizione della cellula ospite.

Figura 1 mostra le immagini acquisite mediante microscopia a fluorescenza. Nelle cellule infettate finte (figure 1a-1d), nuclei appaiono rosso vivo a causa di trascrizione in corso. Poiché le cellule sono state solo etichettato con UE per 1 ora, seguito da fissaggio immediato, la maggior parte rimangono RNA nel nucleo. Al contrario, quando le cellule sono state trattate con ACTD per inibire farmacologicamente trascrizione (figure 1e-1H), la fluorescenza rossa di nuclei è marcatamente ridotta. Questa fluorescenza è altrettanto ridotta quando le cellule sono infettate con MP-12 (Figure 1n-1Q), ma non con le NSS delezione mutanti rMP12-C13type (figure 1i-1M). Figura 2 mostra anche le immagini acquisite al microscopio a fluorescenza, ma qui le cellule sono state trasfettate con mRNA sintetizzato in vitro invece di infezione da virus vivo. Quando le cellule sono state trasfettate con mRNA codificante GFP (figure 2g-2i), nessun cambiamento in transattività criptional rispetto alle cellule non trasfettate (Figure 2a-2c), come visualizzato mediante fluorescenza rossa nei nuclei, può essere rilevato. Solo trasfezione con mRNA codificante le RVFV virulenza NSS factor (figure 2k-2m) risultati in diminuzione fluorescenza rossa.

Figura 3A illustra dati quantitativi ottenuti mediante citometria a flusso. I dati sono rappresentati come grafici a dispersione con segnale fluorescente per incorporazione UE in RNA nascenti tracciati sul l'asse y, e che per la colorazione anti-RVFV tracciati sul l'asse x. I cancelli quadrante sono stati fissati in modo che la maggior parte delle cellule infette finti era situato nel quadrante superiore sinistro, la maggioranza delle cellule trattate ACTD era situato nel quadrante inferiore sinistro, e la maggioranza delle cellule infettate era situato nella metà destra del grafico . Quando le cellule sono state infettate con MP-12, 81,5% del totale delle cellule, o il 93% di cellule positive anti-RVFV, hanno mostrato una ridotta attività trascrizionale. Al contrario, whele cellule sono state infettate con n-rMP12 C13type, 91,6% delle cellule totali, o 97% di cellule positive anti-RVFV, hanno mostrato attività trascrizionale che era paragonabile a quella delle cellule infette finte. Figura 3B illustra gli stessi dati della figura 3A in forma di un istogramma per fluorescenza RNA etichettatura con l'incorporazione UE.

Figura 1
Figura 1. Microscopia a fluorescenza di cellule infettate con MP-12 e rMP12-C13type. 293 cellule fosse finto infetti o infettati sia con MP-12 o la cancellazione NSs mutante RMP-12-C13type. Tra il 15 e il 16 HPI, le cellule sono state marcate con 1 mm EU. Come controllo per la soppressione trascrizionale, cellule infettate finte sono stati trattati con 5 mg / ml ACTD concomitanza con il trattamento UE. Nuclei sono visualizzate tramite colorazione DAPI (blu), l'espressione di proteine ​​virali è visualizzati mediante colorazione con anticorpi anti-RVFV (verde), e l'RNA è visualizzared per il rilevamento della incorporata UE con azide marcato con colorante fluorescente (eccitazione / emissione massima: 590/617 nm) (rosso).

Figura 2
Figura 2. Microscopia a fluorescenza di cellule trasfettate con RNA in vitro sintetizzato per uno GFP o MP-12 NSS. 293 cellule sono state trasfettate finto, o trasfettate con in vitro sintetizzato l'RNA che codifica per uno GFP o MP-12 NSS. Tra il 15 e 16 hr posttransfection, le cellule sono state marcate con 1 mm EU. Come controllo per la soppressione trascrizionale, le cellule transfettate sono state trattate con finte 5 mg / ml ACTD concomitanza con il trattamento UE. L'espressione di GFP è visualizzati mediante colorazione con un anticorpo anti-GFP (gi), l'espressione di NSs è visualizzati mediante colorazione con anticorpi anti-RVFV (af, km) seguito da anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente (eccitazione / emissione maximum: 495/519 nm) (verde), e l'RNA è visualizzato mediante il rilevamento della incorporata UE con azide marcato con colorante fluorescente (eccitazione / emissione massima: 590/617 nm) (rosso).

Figura 3
Figura 3. (A) mediante citometria a flusso delle cellule infettate con MP-12 o rMP12-C13type. Cells erano finto infetti o infettati sia con MP-12 o rMP12-C13type. Tra il 12 e il 13 HPI, le cellule sono state marcate con 0,5 mm EU. Come controllo per la soppressione trascrizionale, le cellule transfettate sono state trattate con finte 5 pg / ml ACTD concomitanza con il trattamento UE. Espressione di proteine ​​virali è visualizzati mediante colorazione con anticorpi anti-RVFV seguito da un anticorpo secondario marcato con colorante fluorescente (eccitazione / emissione massima: 495/519 nm) (anti-RVFV) e RNA viene visualizzato tramite rilevazione della UE incorporato con azide marcato con colorante fluorescente (eccitazione / emissione massima: 650/665 nm) (RNA). Il datuno è rappresentato come un grafico a dispersione. (B) La rappresentanza degli stessi dati mostrati in una forma di istogramma. Intensità di fluorescenza per incorporazione UE è tracciata su l'asse x, la conta delle cellule vengono tracciati sulla y. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Il protocollo fornito descrive un metodo per misurare l'effetto dell'infezione virale sulla trascrizione cellula ospite mediante incorporazione della uridina analogico UE in RNA nascenti. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi precedenti: è veloce, sensibile, e non si basa sull'impiego di isotopi radioattivi. Inoltre, il metodo può essere adattato per produrre dati qualitativi tramite microscopia a fluorescenza o dati quantitativi tramite citometria a flusso utilizzando essenzialmente gli stessi reagenti. Se combinato con immunofluorescenza per antigeni virali, questo metodo permette anche di differenziare il ricercatore infettato da cellule non infettate.

E 'importante notare che questo metodo etichetta anche l'RNA virale di nuova sintesi con la stessa velocità come etichetta trascrizioni di accoglienza, un inconveniente che è condiviso con altri metodi basandosi su 3 H-uridina o bru incorporazione. Almeno nel caso di RVFV MP-12 infezione, tuttavia, abbiamo trovato che l'amount di trascritti host mediante supera di gran lunga la quantità di trascritti virali, e così l'influenza di RNA virale su RNA totale misurata da questo test è trascurabile. Momento dell'adeguamento di tale protocollo per l'uso con un altro virus, i ricercatori potrebbero voler identificare trascritti virali sia attraverso la loro localizzazione, attraverso il trattamento delle cellule infettate con ACTD, o se fluorescente di ibridazione in situ (FISH) 15. Se il virus si replica nel citoplasma, come MP-12, poi RNA virali possono essere facilmente distinguibili da RNA cellulare, che è ancora in gran contenuto nel nucleo dopo 1 ora di etichettatura. Cellule infette possono anche essere trattati con ACTD per sopprimere trascrizione cellula ospite lasciando sintesi di RNA virale inalterati. Funzioni ACTD legandosi al DNA a doppio filamento 16 e quindi inibisce solo la trascrizione del DNA-dipendente, ma non ha alcun effetto sulla virale RNA polimerasi RNA-dipendente.

Durante l'esecuzione di questo protocollo, è fondamentale per evitarecontaminazione con nucleasi tra la permeabilizzazione e la reazione di marcatura click, come UE marcati RNA rimane sensibile alla degradazione da RNasi 3. Inoltre, i ricercatori dovrebbero procedere immediatamente la reazione di marcatura scatto, come tempi di incubazione prolungati tra fissazione e clicca etichettatura reazione, anche a 4 ° C, portare alla degradazione dell'RNA e in definitiva risultare in una perdita del segnale di fluorescenza RNA. Questo è particolarmente importante quando si eseguono esperimenti di time-corso, i ricercatori dovrebbero progettare i loro esperimenti in modo che tutte le celle possono essere etichettati, fissate e colorate allo stesso tempo. Fortunatamente, il segnale di fluorescenza RNA rimane stabile dopo la reazione di marcatura scatto, in modo che il protocollo può essere facilmente fermato dopo questo passo.

Infine, i ricercatori devono tenere presente che l'effetto citopatico (CPE) causata da molti virus influenza negativamente la sintesi di RNA cellulare anche in assenza di qualsiasi specifica repressione trascrizionale. Eè quindi importante misurare l'attività trascrizionale ad una infezione alberino tempo quando le cellule sono ancora vitali. Se un virus mutante è disponibile che non ha la capacità di sopprimere la trascrizione, come RMP-12-C13type (figure 1 e 3), questo può essere un grande strumento per determinare il punto di tempo ottimale per misurare la trascrizione.

Quando si pianifica un gran numero di esperimenti, i ricercatori potrebbe prendere in considerazione etichettatura diretta del loro anticorpo primario con un fluorocromo 17, eliminando così la necessità di un anticorpo secondario e riducendo il tempo necessario per il rilevamento di antigeni virali.

In sintesi, questo protocollo fornisce un modo rapido e affidabile per misurare l'effetto dell'infezione virale sulla trascrizione cellula ospite. Può essere facilmente adattato per l'uso con diversi virus e ha il potenziale per essere modificato per includere immunostainings per le proteine ​​virali o cellulari specifici.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo RB Tesh per fornire il mouse policlonale anti-RVFV antisiero e M. Griffin del UTMB Citometria a Flusso Nucleo Struttura per un aiuto con la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da 5 U54 AI057156 attraverso l'occidentale Centro Regionale di Eccellenza, NIH R01 AI08764301, e il finanziamento del Centro per lo Sviluppo Sealy Vaccino a UTMB.BK è stato sostenuto dalla James W. McLaughlin Fellowship Fund presso UTMB.OL è stato sostenuto da un Maurice R. Hilleman fase iniziale di carriera Career Investigator Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-ethynyl-uridine Berry Associates PY 7563 dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips Fisherbrand 12-545-82
5 ml polystyrene tubes BD Biosciences 352058
Actinomycin D (ActD) Sigma 9415 dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz sc-2323
CuSO4 Sigma C-8027 dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI Sigma D-9542 dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen 11965092
FBS Invitrogen 16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) Invitrogen A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) Invitrogen A10277
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
L-ascorbic acid Sigma A-5960 dissolve in H2O for 500 mM
paper filter VWRbrand 28333-087
paraformaldehyde Sigma 158127
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000) Sigma P1274
Triton X-100 Sigma T-8787
Trizma base Sigma T-1503 dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056
Fluorescence Microscope e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

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References

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Head, J. A., Ikegami, T. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (78), e50809, doi:10.3791/50809 (2013).

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