细胞器运输的培养<em>果蝇</em>细胞：S2细胞系和原代神经元。
Summary
果蝇 S2细胞和培养的神经元是用于体内电机驱动的细胞器运输的成像大的系统。在这里，我们将详细介绍协议进行培养两种细胞类型，它们的成像和运输分析。
Abstract
果蝇 S2细胞中填充有一致极化微管任何肌动蛋白解聚药物形式长直链的过程的存在下接种在盖玻片上。沿着这些过程通过微管马达的细胞器移动。易维护，高灵敏度RNAi介导的蛋白敲除和有效的程序来创建稳定的细胞系使果蝇 S2细胞中一种理想的模型系统，通过实时成像研究货物运输。与S2细胞中获得的结果可被进一步应用到多种生理上相关的系统：在从分离的果蝇胚胎培养的原代神经元的轴突运输。培养神经元长出长突起充满微管捆绑在一起，非常类似于S2的过程。像S2细胞，在培养的神经元细胞器可以通过两种细胞器特异性的荧光染料，或通过使用由DNA编码的荧光标记的细胞器可视化注入到早期胚胎或表达transgenIC苍蝇。因此，细胞器运输可以很容易地记录在神经元上使用生活成像盖玻片培养。在这里，我们描述了在果蝇 S2细胞和原代神经元培养和可视化货物运输手续。我们相信，这些协议使两个系统的实验室研究货物运输方便。
Introduction
果蝇 S2细胞中都获得了学习许多细胞过程日益普及。这些细胞最初是从OregonR 果蝇的胰酶消化后期胚胎获得和维持巨噬细胞样特性1。 果蝇 S2细胞中提供了许多优于其他细胞系。它们被培养于25℃无CO 2，并且可以成像在室温下几个小时，无需加热或气体交换的需要。更重要的是， 果蝇 S2细胞对RNAi的治疗，允许感兴趣的蛋白质的高效率击倒非常敏感。 S2细胞的高效转染和稳定的细胞系可以在不到四周的时间进行选择，以便感兴趣的蛋白的稳定表达。 S2细胞正常生长，无论是松散连接，但不能涂在烧瓶或悬浮状态。它们可以诱导铺展在盖玻片预涂用植物凝集素孔卡navalin A（刀豆）。扩散细胞的周围是特别薄的，因此是理想的活细胞显微镜检查。为S2细胞培养，RNA干扰治疗，现场光成像和免疫组化的详细方案可以在文献2,3中找到。我们的实验室已采用S2细胞作为模型系统来研究微管为基础的货物运输。与任何药物解聚或切断的F-肌动蛋白，如细 胞松弛素D（CytoD）处理过的果蝇 S2细胞，长长的过程充满了均匀极化微管4 -10，这使它成为理想的系统来研究货物运输沿微管阵列。交通工具在这些过程中不同的参数（ 即轨迹长度，速度，方向性等 ）可以使用自动化粒子跟踪软件，DiaTrack（Semasopht很容易地测量：http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423;博士。帕斯卡尔·瓦洛：http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx＃A4）。这些特性使得S2细胞一个有吸引力的制度研究货物运输以及在组织培养细胞中的微管。
在S2细胞试验实验可以扩展到在果蝇原代神经元的货物运输研究的一个重要的生理模型。类似于S2细胞，神经元的解离胚胎培养是可渗透的小分子物质，例如染料和抑制剂，并且可以在神经元中，在室温下进行的细胞器运输的高分辨率实时成像。利用果蝇与不同的遗传背景，我们可以通过基因敲除（丧失功能的基因突变）研究基因功能的初级神经元，击倒（双链RNA注射或表达式）或异位表达（转基因果蝇）。具体来说，使用CytoD治疗肌动蛋白丝的碎片不会阻止轴突生长，相反，他们成长得更快，因此，我们可以研究微管depende在CytoD处理的神经元新台币细胞器运输无肌动蛋白的影响丝11。因此，初级神经元培养结合组织培养细胞的优点和飞遗传学，这使它成为一个伟大的系统来研究货物运输在生理相关的系统10,12。因为几个家族性神经变性疾病可能由以下原因引起或与货物运输的缺陷（ 例如，帕金森氏病13相关联，亨廷顿氏病14，阿尔茨海默氏病15,16，肌萎缩性侧索硬化症/ ALS 17，HMN7B和佩里综合征18,19，和脊髓小脑性共济失调型5/SCA5 20），原代神经元培养物可以是在特定突变对微管依赖性的传输造成这些疾病的影响的分析是有用的。
最后，微管依赖性运输的重要性能哺乳动物和果蝇之间非常保守，但<em>果蝇基因和细胞培养物是不太昂贵和费时的，正当的使用培养的果蝇细胞在正常和病理条件下研究细胞器运输的基本方面。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提出了用于研究微管相关货物运输在果蝇 S2细胞和原代神经元培养的详细协议。既S2流程和突起结构是由充满了作为细胞器运输轨道捆绑微管阵列。
两种策略通常用于标签的细胞器：载体与细胞器靶向序列或染色用直接添加到培养物的荧光染料编码荧光蛋白的转染。的货物标签，常见的例子列于表1中 。 果蝇 S2细胞中瞬时转染或RNAi治疗…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢实验室的Gelfand谁促成了这些协议的开发成员。研究报告本出版物中由美国国立卫生研究院国家普通医学科学根据奖号R01GM052111国家学院VIG和教育巴斯克政府部门，大学和研究下奖号BFI-2011-295 UDC得到了支持。
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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