교양있는 세포 기관 전송<em> 초파리</em> 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.
Summary
초파리 S2 세포 배양 신경 세포가 생체 내에서 모터 구동 세포 기관 수송의 이미징을위한 좋은 시스템입니다. 여기에서 우리는 두 종류의 세포를 배양에 대한 자신의 이미징 및 교통 분석을 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
초파리 S2 세포는 균일하게 편광 된 미세 소관으로 가득 어떠한 액틴 해중합 약물 형태 긴 측쇄 프로세스의 존재 커버 슬립에서 도금했다. 세포 기관은 미세 소관 모터에 의해 이러한 프로세스를 따라 이동합니다. 쉬운 유지 보수, RNAi를 매개 단백질 노크 다운 및 안정적인 세포 라인을 만들기위한 효율적인 절차와 높은 감도는 초파리 S2 세포에게 라이브 영상으로화물 운송을 연구하는 이상적인 모델 시스템을 확인합니다. 해리 초파리 배아로부터 배양 된 신경 세포의 축삭 차 수송 : S2 세포로 얻어진 결과는 더욱 더 생리학 관련 시스템에 적용될 수있다. 배양 된 신경 세포는 S2 프로세스와 매우 유사 번들 미세 소관, 가득 긴 신경 돌기 성장. 같은 S2 세포에서 배양 된 신경 세포 소기관이 세포 내 소기관 중 하나를 특정 형광 염료 또는 DNA에 의해 암호화 형광 세포 기관 마커를 사용하여 시각화 할 수있는 초기 배아에 주입 또는 transgen 표현IC는 파리. 따라서 소기관 수송 간단 리빙 이미징을 사용하여 유리 커버 슬립에서 배양 된 신경 세포에서 기록 될 수있다. 여기에서 우리는 초파리 S2 세포 및 기본 뉴런에화물 운송을 배양하고 시각화하는 절차에 대해 설명합니다. 우리는 이러한 프로토콜은화물 수송을 연구 실험실에 대한 두 시스템에 액세스 할 수 있도록 믿습니다.
Introduction
초파리 S2 세포는 많은 세포 과정을 공부 증가 인기를 얻고있다. 이러한 세포는 원래 OregonR 초파리 melanogaster의 트립신의 최종 단계의 배아로부터 얻어지는 1. 초파리 S2 세포가 다른 세포주에 비해 많은 장점을 제공 식세포와 같은 기능을 유지 하였다. 그들은 CO 2없이 25 ° C에서 배양하고, 가열 또는 가스 교환의 필요없이 상온에서 많은 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 더 중요한 것은, 초파리 S2 세포는 그 단백질의 고효율 최저를 허용 RNAi의 치료에 매우 민감하다. S2 세포는 높은 형질이며 안정적인 세포주는 또한 단백질의 안정 이소성 발현을 허용 미만 사주에서 선택 될 수있다. S2 세포는 일반적으로 하나 성장 느슨하게 연결된하지만 플라스크 또는 정지에 확산되지. 그들은 식물 렉틴 콩카와 프리 코트 커버 슬립에 확산하도록 유도 할 수있다navalin A (CONA). 확산 세포의 주변은 특히 얇은 때문에 살아있는 세포 현미경에 이상적입니다. S2 세포 배양, RNAi의 치료, 라이브 광 이미징 및 면역 염색에 대한 자세한 프로토콜은 문학 2,3에서 찾을 수 있습니다. 우리 연구실은. 같은 사이토 D로 F-액틴을 해중합 또는 끊고 마약, (CytoD)으로 처리 초파리 S2 세포가 균일하게 편광 미세 소관 4 가득 긴 프로세스를 성장 미세 소관 기반의화물 운송을 연구하는 모델 시스템으로 S2 세포를 채택했다 10, 그 미세 소관 배열에 따라화물의 움직임을 연구 할 수있는 이상적인 시스템을 만드는. 이러한 과정에서 전송의 다른 매개 변수 (. 즉 궤도의 길이, 속도, 방향성 등)을 쉽게 자동화 된 입자 추적 소프트웨어를 DiaTrack (Semasopht 사용하여 측정 할 수 있습니다 http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; 박사 . 파스칼 Vallotton : http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). 이러한 속성은 S2 세포에게 조직 배양 세포의 미세 소관을 따라화물 수송을 연구 매력적인 시스템을 확인합니다.
S2 세포에서의 파일럿 실험은 초파리 차 뉴런에서화물 운송 연구의 중요한 생리 학적 모델로 확장 될 수있다. S2 세포와 유사하게, 해리 된 배아로부터 배양 된 신경 세포는 염료와 같은 작은 분자 억제제에 대한 투과성 및 소기관 수송의 고해상도 실시간 이미징 실온에서 뉴런에서 수행 될 수있다. 다른 유전 적 배경을 가진 초파리를 사용하여, 우리는 녹아웃 (유전자 기능 상실 돌연변이)에 의해 기본 뉴런 유전자의 기능을 검사 할 수 있습니다, 최저 (dsRNA를 주입 또는 표현) 또는 자궁외 식 (유전자 변형 파리). 특히, CytoD 치료를 사용하여 액틴 필라멘트의 분열은 신경 돌기의 파생물을 방지하지 않는 대신 그들은 빠르게 성장하고, 따라서 우리는 미세 소관 depende를 공부할 수 있습니다굴지의 영향없이 CytoD 처리 된 신경 세포 NT 소기관 전송 11 필라멘트. 따라서, 기본의 연결을 문화는 생리 관련 시스템 (10, 12)에화물 운송을 연구 할 수있는 좋은 시스템을 만드는, 조직 배양 세포의 장점을 결합하고 유전자를 비행. 여러 가족 퇴행성 신경 질환에 의해 발생 또는화물 수송 결함 (예를 들면 파킨슨 병 (13)와 연관 될 수 있기 때문에, 헌팅턴 병 (14), 알츠하이머 병 (15, 16), 루게릭 병 / ALS 17 HMN7B 및 페리 증후군 18, 19, 및 척수 소뇌 실조증 유형 5/SCA5 20), 기본의 연결을 문화가 미세 소관 의존 전송에이 질병을 일으키는 특정 돌연변이의 효과 분석에 유용 할 수 있습니다.
마지막으로, 미세 소관에 의존하는 교통의 중요한 속성은 잘 포유 동물과 파리 사이에 보존되지만, <em> 초파리 유전자 및 세포 배양 정상 및 병리학 적 상태에서 소기관 수송의 필수적인 측면을 연구하기위한 배양 된 초파리 세포의 사용을 정당화하는, 덜 비싸고 시간 소모적이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 초파리 S2 세포와 차 신경 세포 배양에서 미세 소관 따라화물 수송 공부를위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 두 S2 프로세스와 신경 돌기는 세포 기관의 수송을위한 트랙 역할을 번들로 미세 소관 배열로 채워 구조입니다.
두 가지 전략은 일반적으로 라벨 세포 기관에 사용됩니다 문화에 직접 추가 형광 염료를 가진 세포 기관 타겟팅 순서 나 염색과 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이러한 프로토콜의 발전에 기여 Gelfand는 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 BFI-2011-295 UDC에 아래 VIG에 보너스 번호 R01GM052111에서 건강의 국립 연구소의 일반 의료 과학 국립 연구소 바스크 정부 교육부, 대학 및 연구에 의해 지원되었다.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
