אברון תחבורה בתרבית<em> דרוזופילה</em> תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.
Summary
תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.
Abstract
תאי דרוזופילה S2 מצופים על coverslip בנוכחות של כל תהליכי unbranched ארוכי צורת תרופת depolymerizing-אקטין מלאים microtubules אחיד מקוטב. אברונים לנוע לאורך תהליכים אלה על ידי מנועים microtubule. תחזוקה קלה, רגישות גבוהה לחלבון RNAi בתיווך לדפוק למטה והליך יעיל ליצירת שורות תאי יציבות להפוך תאי דרוזופילה S2 מערכת מודל אידיאלי ללמוד הובלת מטענים על ידי הדמיה לחיות. התוצאות שהושגו עם תאי S2 יכולות להיות מיושמות בהמשך ליותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מערכת: תחבורת אקסון בנוירונים העיקרי בתרבית מעוברי דרוזופילה ניתקו. נוירונים בתרבית לגדול neurites הארוכה מלאות microtubules ארוזים, דומה מאוד לתהליכי S2. כמו בתאי S2, האברונים בנוירונים בתרבית ניתן דמיינו ידי שני צבעי ניאון אברון ספציפי או באמצעות סמני אברון ניאון המקודדים על ידי DNA מוזרק לתוך עובריים מוקדם או לידי ביטוי בtransgenic זבובים. לכן, תחבורת אברון ניתן להקליט בקלות בנוירונים בתרבית על coverslips זכוכית באמצעות הדמיה חי. כאן אנו מתארים נהלים לculturing חזותי הובלת מטענים בתאי דרוזופילה S2 ונוירונים עיקרי. אנו מאמינים כי הפרוטוקולים הללו להפוך את שני המערכות נגישות למעבדות לימוד הובלת מטענים.
Introduction
תאי דרוזופילה S2 צברו פופולריות הולכת וגוברת ללימוד תהליכים תאיים רבים. תאים אלה התקבלו במקור מעוברים בשלב מאוחר trypsinized של OregonR תסיסנית ולשמור על תכונות כמו מקרופאג-1. תאי דרוזופילה S2 מציעים יתרונות רבים על פני שורות תאים אחרות. הם מתורבתים ב25 מעלות צלזיוס בלי CO 2, ויכולים להיות צילמו במשך שעות רבות בטמפרטורת חדר ללא הצורך בחימום או חילוף גזים. חשוב מכך, תאי דרוזופילה S2 רגישים מאוד לטיפול RNAi המאפשר מציאה יעילות גבוהה של חלבונים של עניין. תאי S2 הם transfectable מאוד יכולים להיות שנבחרו שורות תאי יציבות בפחות מארבעה שבועות, כדי לאפשר ביטוי אקטופי היציב של חלבונים של עניין. תאי S2 בדרך כלל גם לגדול מחוברים באופן רופף, אך לא התפשטו בבקבוק או בהשעיה. הם יכולים להיגרם להתפשט על coverslips precoated עם קונקה לקטינים צמחnavalin (ConA). הפריפריה של תאי ההתפשטות היא דקה במיוחד, ולכן הוא אידיאלי למיקרוסקופיה תא חי. ניתן למצוא בפרוטוקולים מפורטים לתרבות תאי S2, טיפול RNAi, הדמיה אור חי וimmunostaining ב2,3 הספרות. המעבדה שלנו אימצה תאי S2 כמערכת מודל ללמוד הובלת מטענים מבוסס microtubule. תאי דרוזופילה S2 שטופלו בכל תרופה שdepolymerizes או קוטעת F-אקטין, כגון cytochalasin D (CytoD), לגדול תהליכים ארוכים מלאים microtubules אחיד המקוטב 4 -10, מה שהופך את מערכת אידיאלית ללמוד תנועת מטענים לאורך מערכי microtubule. פרמטרים שונים של הובלה בתהליכים אלו (. כלומר אורכי מסלולים, מהירויות, יווניות וכו ') ניתן למדוד בקלות באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים אוטומטית, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; ד"ר . פסקל אלוטון: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-I# Nformatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx A4). תכונות אלו הופכות את תאי S2 מערכת מושכת ללימוד הובלת מטענים לאורך microtubules בתאים בתרבית רקמה.
ניסויי פיילוט בתאי S2 יכולים להתארך למודל חשוב מבחינה פיזיולוגית של מחקרי הובלת מטענים בנוירונים עיקרי דרוזופילה. בדומה לתאי S2, נוירונים בתרבית מעוברים ניתקו הם חדירים למולקולות קטנות, כגון צבעים ומעכבים, והדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של תחבורת אברון יכולה להתבצע בתאי עצב בטמפרטורת חדר. שימוש בדרוזופילה עם רקע גנטי שונה, אנו יכולים לבחון את תפקוד גן בנוירונים עיקרי בנוקאאוט (מוטציות אובדן של הפונקציה גנטיות), מציאה (הזרקת dsRNA או ביטוי) או ביטוי אקטופי (זבובים מהונדסים). באופן ספציפי, פיצול של סיבי אקטין באמצעות טיפול CytoD אינו מונע תולדת neurite, אלא הם גדלים מהר יותר, ובכך אנו יכולים ללמוד microtubule-dependeתחבורת אברון NT בנוירונים שטופלו CytoD ללא ההשפעה של אקטין חוטי 11. לכן, תרבויות עצביות עיקריות לשלב את היתרונות של תאים בתרבית רקמה ולעוף גנטיקה, מה שהופך את מערכת נהדרת ללמוד הובלת מטענים במערכת רלוונטית פיזיולוגית 10,12. מאז כמה מחלות ניווניות משפחתיות יכולים להיגרם על ידי או קשורה עם מומי הובלת מטענים (למשל מחלת פרקינסון 13, מחלת הנטינגטון 14, מחלת אלצהיימר 15,16, Amyotrophic Lateral Sclerosis / 17 ALS, תסמונת HMN7B ופרי 18,19, וסוג אטקסיה spinocerebellar 5/SCA5 20), תרבויות עצביות עיקריות יכולות להיות שימושיות בניתוח של ההשפעות של מוטציות מסוימות גורמות למחלות אלה בתחבורה microtubule תלוי.
לבסוף, מאפיינים חשובים של תחבורת microtubule תלוי הם נשמרים גם בין יונקים וזבובים, אבל <em> התרבות גנטית ותאים דרוזופילה היא פחות יקרה וגוזל זמן, המצדיקה את השימוש בתאי דרוזופילה תרבותיים ללימוד היבטים חיוניים של תחבורת אברון בתנאים נורמלים ופתולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ללימוד הובלת מטעני microtubule תלוי בתאי דרוזופילה S2 ותרבות הנוירון ראשוני. שני תהליכי S2 וneurites הם מבנים מולא על ידי מערכי microtubules ארוזים המשמשים כמסלולים לתחבורת אברון.
שתי אסטרטגיות משמשות בדרך …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברים במעבדה גלפנד שתרם לפיתוח של פרוטוקולים אלה. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי למדע כללי רפואי של המכון הלאומי לבריאות במספר הפרסים R01GM052111 לVIG ועל ידי הבסקים מחלקה ממשלתית לחינוך, אוניברסיטאות ומחקר תחת BFI-2,011-295 מספר הפרסים לUDC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
