Transporte Organelle em Cultivadas<em> Drosophila</em> Células: Linha celular S2 e primário neurônios.
Summary
Células Drosophila S2 e neurônios cultivados são grandes sistemas para a imagem latente de transporte organela motorizado in vivo. Aqui nós descrevemos protocolos detalhados para o cultivo de ambos os tipos de células, a sua imagem e análise de transporte.
Abstract
As células S2 de Drosophila semeadas em uma lamela, na presença de quaisquer processos longos não ramificados formam droga-despolimerização da actina cheios com microtúbulos uniformemente polarizadas. Organelos mover ao longo destes processos pelos motores de microtúbulos. Fácil manutenção, de alta sensibilidade à proteína do RNAi mediada por knock-down e procedimento eficiente para a criação de linhas celulares estáveis fazer células Drosophila S2 um sistema modelo ideal para estudar o transporte de carga por imagens ao vivo. Os resultados obtidos com as células S2 podem ainda ser aplicado a um sistema mais fisiologicamente relevante: o transporte axonal em neurónios primários cultivadas a partir de embriões de Drosophila dissociados. Neurônios cultivados crescer neurites longos cheios de microtúbulos empacotados, muito semelhantes aos processos S2. Como em células S2, organelas em neurônios cultivados pode ser visualizado por qualquer corantes fluorescentes específicos de organelas ou usando marcadores fluorescentes organelas codificadas pelo DNA injetado em embriões ou expressa em transgénicaic voa. Portanto, o transporte organela pode ser facilmente gravado em neurônios cultivados em lamínulas usando imagens vivas. Aqui nós descrevemos os procedimentos de cultura e visualizando o transporte de carga em células Drosophila S2 e neurônios primários. Acreditamos que estes protocolos fazer os dois sistemas acessíveis para os laboratórios que estudam o transporte de carga.
Introduction
Células Drosophila S2 ganharam popularidade crescente para estudar muitos processos celulares. Estas células foram originalmente obtidas a partir de embriões de fase tardia com tripsina de OregonR Drosophila melanogaster e manter as características de macrófagos como 1. Células S2 de Drosophila oferecem muitas vantagens em relação a outras linhas celulares. Elas são cultivadas a 25 ° C, sem CO 2, e podem ser visualizados por várias horas à temperatura ambiente, sem a necessidade de aquecimento ou de permuta de gás. Mais importante, as células de Drosophila S2 são muito sensíveis a um tratamento de alta eficiência, permitindo RNAi knockdown de proteínas de interesse. As células S2 são altamente transfectable e linhas celulares estáveis pode ser seleccionada em menos de quatro semanas para permitir que a expressão ectópica estável de proteínas de interesse. As células S2 normalmente crescem ou fracamente ligado, mas não se espalhou sobre uma garrafa ou em suspensão. Eles podem ser induzidas para se espalhar em lamelas previamente revestidas com uma lectina de planta concanavalin A (ConA). A periferia das células de propagação é especialmente fina e, portanto, é ideal para a microscopia de células vivas. Os protocolos detalhados para a cultura de células S2, tratamento de RNAi, imagiologia de luz vivo e imunocoloração pode ser encontrada na literatura 2,3. O nosso laboratório adoptou células S2 como um sistema modelo para o estudo de transporte de carga à base de microtúbulos. Células S2 de Drosophila tratadas com qualquer droga que despolimeriza ou rompe F-actina, tais como a citocalasina D (CytoD), crescem processos longos cheios de microtúbulos uniformemente polarizadas 4 -10, o que o torna um sistema ideal para estudar a movimentação de cargas ao longo de matrizes de microtúbulos. Diferentes parâmetros de transporte nesses processos (ou seja. Trajetórias comprimentos, velocidades, direcionalidade, etc) pode ser facilmente medido usando o software de rastreamento de partículas automatizada, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr. . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Estas propriedades fazem células S2 um sistema atraente para o estudo de transporte de carga ao longo dos microtúbulos em células de cultura de tecidos.
Experiências-piloto em células S2 pode ser estendido para um modelo fisiologicamente importante de estudos de transporte de carga em Drosophila neurônios primários. Semelhante para células S2, neurónios cultivados a partir de embriões dissociadas são permeáveis a moléculas pequenas, tais como corantes e inibidores, e alta resolução de imagem ao vivo de transporte organela pode ser realizada em neurónios à temperatura ambiente. Usando Drosophila com diferentes origens genéticas, podemos examinar a função do gene em neurônios primários por nocaute (genéticos mutações de perda de função), knockdown (injeção dsRNA ou expressão) ou expressão ectópica (moscas transgênicas). Especificamente, a fragmentação dos filamentos de actina utilizando tratamento CytoD não impede crescimento de neuritos, em vez disso eles crescem mais rápido e, assim, podemos estudar microtúbulos-dependtransporte organela nt em neurônios tratados com CytoD sem a influência de filamentos de actina 11. Portanto, culturas neuronais primárias combinam as vantagens das células de cultura de tecidos e genética voar, o que o torna um grande sistema para estudar o transporte de carga em um sistema relevante fisiológica 10,12. Uma vez que várias doenças neurodegenerativas familiares poderiam ser causadas por ou associadas com os defeitos de transporte de carga (por exemplo, doença de Parkinson 13, doença de Huntington 14, a doença de Alzheimer 15,16, Esclerose Lateral Amiotrófica / ALS 17, HMN7B e Perry síndrome 18,19, e tipo de ataxia espinocerebelar 5/SCA5 20), as culturas neuronais primárias podem ser úteis na análise dos efeitos das mutações específicas que causam estas doenças em transporte dependente de microtúbulos.
Finalmente, as propriedades importantes de transporte dependente de microtúbulos são bem conservada entre os mamíferos e as moscas, mas <em> Cultura genética e células de Drosophila é menos caro e demorado, o que justifica o uso de células de Drosophila cultivadas para estudar aspectos essenciais de transporte organela em condições normais e patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos protocolos detalhados para estudar o transporte de carga dependente de microtúbulos em células Drosophila S2 e cultura neurônio primário. Ambos os processos e neurites S2 são estruturas preenchidas por pacotes de microtúbulos matrizes que servem como pistas para o transporte de organelas.
Duas estratégias são normalmente utilizados para organelas rótulo: transfecção de vetores que codificam uma proteína fluorescente com uma seqüência de metas organela…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório Gelfand que contribuíram para o desenvolvimento destes protocolos. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número prêmio R01GM052111 para VIG e pelo Departamento de Governo Basco da Educação, Universidades e Pesquisa sob o número prêmio BFI-2011-295 a UdC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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