خلايا ذبابة الفاكهة S2 والخلايا العصبية مثقف هي أنظمة كبيرة للتصوير النقل عضية بالمحركات في الجسم الحي. نحن هنا تصف بروتوكولات مفصلة لزراعة كل من أنواع الخلايا، والتصوير، وتحليل النقل.
خلايا ذبابة الفاكهة S2 مطلي على ساترة في وجود أي شكل من المخدرات depolymerizing الأكتين العمليات غير متفرعة طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة الاستقطاب بشكل موحد. العضيات تتحرك هذه العمليات من قبل محركات أنيبيب. سهولة الصيانة، وحساسية عالية لبروتين رني بوساطة تدق إلى أسفل وإجراءات فعالة لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة تجعل خلايا ذبابة الفاكهة S2 نظام نموذج مثالي لدراسة نقل البضائع عن طريق التصوير الحي. النتائج التي تم الحصول عليها مع الخلايا S2 يمكن تطبيقها إضافية لنظام أكثر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية: نقل محور عصبي في الخلايا العصبية الأولية مثقف من أجنة ذبابة الفاكهة فصلها. تنمو الخلايا العصبية مثقف neurites التي طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة المجمعة، تشبه الى حد بعيد عمليات S2. كما هو الحال في خلايا S2، العضيات في الخلايا العصبية مثقف يمكن تصور من قبل أي عضية محددة الأصباغ الفلورية أو باستخدام علامات عضية الفلورسنت المشفرة بواسطة الحمض النووي حقنها في أجنة مبكرة أو المعبر عنها في transgenجيم الذباب. وبالتالي، النقل عضية يمكن تسجيلها بسهولة في الخلايا العصبية مثقف على coverslips الزجاج باستخدام التصوير الحي. نحن هنا وصف الإجراءات لزراعة وتصور نقل البضائع في خلايا ذبابة الفاكهة S2 والخلايا العصبية الأولية. ونحن نعتقد أن هذه البروتوكولات جعل كلا النظامين للوصول للمختبرات دراسة نقل البضائع.
اكتسبت خلايا ذبابة الفاكهة S2 شعبية متزايدة لدراسة العديد من العمليات الخلوية. وقد تم الحصول على هذه الخلايا في الأصل من trypsinized الأجنة مرحلة متأخرة من OregonR ذبابة الفاكهة السوداء البطن والحفاظ على ميزات مثل بلعم 1. خلايا ذبابة الفاكهة S2 توفر العديد من المزايا أكثر من خطوط الخلايا الأخرى. هم مثقف عند 25 درجة مئوية دون CO 2، ويمكن تصوير لساعات طويلة في درجة حرارة الغرفة دون الحاجة للتدفئة أو تبادل الغاز. الأهم من ذلك، خلايا ذبابة الفاكهة S2 حساسة للغاية للعلاج رني السماح كفاءة عالية من البروتينات ضربة قاضية من الفائدة. خلايا S2 هي transfectable للغاية وخطوط الخلايا مستقرة يمكن تحديدها في أقل من أربعة أسابيع للسماح للتعبير خارج الرحم مستقرة البروتينات المثيرة للاهتمام. خلايا S2 عادة تنمو إما فضفاضة يعلق ولكن لم ينتشر على قارورة أو في التعليق. أنها يمكن أن يتسبب في نشر coverslips على precoated مع كونكا كتين النباتnavalin A (كونا). هامش انتشار خلايا رقيقة خاصة، وبالتالي يعتبر مثاليا للفحص المجهري الخلية الحية. بروتوكولات مفصلة للثقافة الخلايا S2، العلاج رني، والتصوير ضوء الحية والمناعية ويمكن العثور عليها في 2،3 الأدب. وقد اعتمدت لدينا مختبر الخلايا S2 كنظام نموذج لدراسة نقل البضائع على أساس أنيبيب. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تعامل مع أي نوع من المخدرات التي depolymerizes أو يقطع F-الأكتين، مثل مثبط حركة الخلايا D (CytoD)، وتنمو عمليات طويلة مليئة الأنابيب الدقيقة الاستقطاب بشكل موحد 4 -10، مما يجعله نظام مثالي لدراسة حركة نقل البضائع على طول صفائف أنيبيب. المعلمات النقل المختلفة في هذه العمليات (. أي أطوال المسارات، السرعات، الاتجاهية الخ) يمكن قياسها بسهولة باستخدام البرمجيات الآلي لتتبع الجسيمات، DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423، والدكتور باسكال Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). هذه الخصائص تجعل الخلايا S2 نظام جذابة لدراسة نقل البضائع على طول الأنابيب الدقيقة في الخلايا زراعة الأنسجة.
التجارب الرائدة في الخلايا S2 يمكن أن تمتد إلى نموذج مهمة من الناحية الفسيولوجية للدراسات نقل البضائع في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الأولية. مماثلة لخلايا S2، الخلايا العصبية مثقف من أجنة فصلها هي قابلة للاختراق إلى جزيئات صغيرة مثل الأصباغ ومثبطات، وعالية الدقة التصوير الحي النقل عضية لا يمكن أن يؤديها في الخلايا العصبية في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ذبابة الفاكهة مع خلفيات وراثية مختلفة، ونحن يمكن دراسة وظائف الجينات في الخلايا العصبية الأولية بالضربة القاضية (الجينية الخسارة من وظيفة الطفرات)، ضربة قاضية (الرنا المزدوج الجديلة حقن أو التعبير) أو التعبير خارج الرحم (الذباب المعدلة وراثيا). على وجه التحديد، تفتيت خيوط الأكتين باستخدام العلاج CytoD لا يمنع ثمرة neurite، بدلا من ذلك أنها تنمو بشكل أسرع، وبالتالي يمكننا دراسة أنيبيب-dependeالإقليم الشمالي النقل عضية في الخلايا العصبية CytoD المعاملة دون تأثير الأكتين خيوط 11. وبالتالي، الثقافات العصبية الأولية الجمع بين مزايا الخلايا زراعة الأنسجة وتطير الوراثة، مما يجعل من نظام كبير لدراسة نقل البضائع في نظام الفسيولوجية ذات الصلة 10،12. منذ قد يكون السبب العديد من الأمراض العصبية العائلية من قبل أو المرتبطة العيوب نقل البضائع (مثل مرض باركنسون 13، مرض هنتنغتون 14، 15،16 مرض الزهايمر، التصلب الجانبي الضموري / 17 ALS، وHMN7B بيري متلازمة 18،19، ومخيخي شوكي نوع ترنح 5/SCA5 20)، ويمكن الثقافات العصبية الأولية أن تكون مفيدة في تحليل آثار الطفرات محددة تسبب هذه الأمراض في وسائل النقل التي تعتمد على أنيبيب.
أخيرا، الخصائص الهامة النقل التي تعتمد على أنيبيب يتم حفظها جيدا بين الثدييات والذباب، ولكن <em> الثقافة الوراثية وخلية ذبابة الفاكهة هو أقل تكلفة وتستغرق وقتا طويلا، لتبرير استخدام خلايا ذبابة الفاكهة مثقف لدراسة الجوانب الأساسية للنقل عضية في الظروف العادية والمرضية.
هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لدراسة نقل البضائع تعتمد على أنيبيب في الخلايا ذبابة الفاكهة S2 والثقافة الخلايا العصبية الأولية. كلتا العمليتين S2 وneurites التي هي هياكل يشغلها المجمعة الأنابيب الدقيقة المصفوفات التي تكون بمثابة مسارات للنقل عضية.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
نشكر أعضاء المختبر غيلفاند الذين ساهموا في تطوير هذه البروتوكولات. وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01GM052111 لVIG والباسك وزارة التربية والتعليم الحكومة والجامعات والبحوث تحت رقم الجائزة BFI-2011-295 إلى الشركة المتحدة للتنمية.
Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
Insulin | Sigma | I6634 |
Penicillin | Research Products International | P93000 |
Streptomycin | Research Products International | S62000 |
Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
Concanavalin A | Sigma | C2010 |
Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |