Summary
यह प्रोटोकॉल एक बैक्टीरियल तनाव के लिए प्लैंक्टोनिक और बायोफिल्म प्रतिरोध के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है जो 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करके विट्रो में बायोफिल्म बना सकता है। प्लैंक्टोनिक या बायोफिल्म बैक्टीरिया पसंद के एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के धारावाहिक कमजोर पड़ने के संपर्क में हैं। अगर प्लेटों पर विकास से व्यवहार्यता को आसकित किया जाता है।
Abstract
यह प्रोटोकॉल एक बैक्टीरियल तनाव के लिए प्लैंक्टोनिक और बायोफिल्म प्रतिरोध के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है जो विट्रो मेंबायोफिल्म बना सकता है। बैक्टीरिया एक ९६ अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में टीका लगाया जाता है । प्लैंकटोनिक परख के मामले में, पसंद के एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के सीरियल कमजोर पड़ने बैक्टीरियल निलंबन में जोड़े जाते हैं। बायोफिल्म परख में, एक बार टीका लगाने के बाद, बैक्टीरिया को एक निर्धारित अवधि में बायोफिल्म बनाने के लिए छोड़ दिया जाता है। असंबद्ध कोशिकाओं को कुओं से हटा दिया जाता है, मीडिया को मंगाया जाता है और पसंद के रोगाणुरोधी एजेंट के धारावाहिक कमजोर पड़ने को जोड़ा जाता है। रोगाणुरोधी एजेंट के संपर्क में आने के बाद, प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को विकास के लिए परख दिया जाता है। बायोफिल्म परख के लिए मीडिया को फ्रेश किया जाता है फ्रेश मीडिया में एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की कमी होती है और बायोफिल्म सेल्स को ठीक होने के लिए छोड़ दिया जाता है । वसूली अवधि के बाद बायोफिल्म सेल व्यवहार्यता को आसकित किया जाता है। एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के लिए एमबीसी-पी को दवा की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जो प्लैंक्टोनिक संस्कृति में कोशिकाओं को मारता है। इसके विपरीत, एक तनाव के लिए एमबीसी-बी 24 घंटे के लिए एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की सांद्रता बढ़ाने के लिए प्रीफेड बायोफिल्म्स को उजागर करके निर्धारित किया जाता है। एमबीसी-बी को एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जो बायोफिल्म में कोशिकाओं को मारता है।
Introduction
एंटीबायोटिक प्रतिरोध परख शुरू में बैक्टीरिया की प्लैंक्टोनिक (मुक्त तैराकी) संस्कृतियों के प्रतिरोध परख करने के लिए विकसित किए गए थे। चूंकि कई जीवाणु संक्रमणों में बायोफिल्म (सतह से जुड़ी कोशिकाएं) शामिल हैं, इसलिए हम बायोफिल्म-विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध को परखने के लिए एक विधि विकसित करने में रुचि रखते थे। हालांकि, अधिकांश एंटीबायोटिक प्रतिरोध परख बायोफिल्म्स के प्रतिरोध को मापने के लिए खराब अनुकूल हैं। उदाहरण के लिए, न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) का निर्धारण प्लैंक्टोनिक बैक्टीरियल संस्कृतियों के एंटीबायोटिक प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए स्वर्ण मानक है 1। इस परख एंटीबायोटिक की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ एक पतला प्लैंक्टोनिक संस्कृति मिश्रण जरूरत पर जोर देता है । एंटीबायोटिक की एकाग्रता जो प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के दृश्य विकास को रोकती है, एमआईसी है। चूंकि यह परख विकास के अवरोध पर निर्भर करती है, परिभाषा के अनुसार, यह बायोफिल्म संस्कृतियों के साथ काम नहीं कर सकती, जिसके लिए एक पूर्वउड़ान बायोफिल्म में कोशिकाओं की एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की जांच की आवश्यकता होती है। विकास अवरोध को मापने के बजाय, यहां वर्णित एमबीसी-बी परख एंटीबायोटिक की एकाग्रता निर्धारित करती है जो पहले से ही बायोफिल्म में मौजूद कोशिकाओं को मारता है । इस प्रकार, इस परख का उद्देश्य स्थापित बायोफिल्म संक्रमणों के एंटीबायोटिक उपचारों की नकल करना है, और वीवो मेंबैक्टीरियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अधिक प्रासंगिक दृश्य प्रदान करना है।
चूंकि बायोफिल्म आम तौर पर प्लैंक्टोनिक संस्कृतियों 2-4 की तुलना में अधिक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी होते हैं, इसलिए एक विधि ईजाद करना आवश्यक था जो सीधे बायोफिल्म के एंटीबायोटिक प्रतिरोध को प्लैंक्टोनिक संस्कृति से संबंधित करता है। इस प्रकार इस विधि का एक और लक्ष्य प्लैंक्टोनिक और बायोफिल्म कोशिकाओं के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के स्तर की तुलना करने में सीधे सक्षम होना है। एमबीसी-पी और एमबीसी-बी का वर्णन यह संभव है क्योंकि कोशिकाओं को इसी तरह की परिस्थितियों में सुसंस्कृत कर रहे हैं । हमने बायोफिल्म-विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध 5-8 के लिए महत्वपूर्ण कई जीनों का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है।
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Protocol
1. एमबीसी-बी
-
एक बायोफिल्म बढ़ रहा है (ओ 'तोले9से अनुकूलित)।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक समृद्ध माध्यम में 16 घंटे के लिए ब्याज और उत्परिवर्ती तनाव के जंगली प्रकार तनाव की संस्कृति बढ़ें।
- एंटीबायोटिक प्रतिरोध परख के लिए ताजा माध्यम में संतृप्त रातोंरात संस्कृतियों 1:100 पतला । पी एरुगिनोसा के लिए एक मानक माध्यम M63 न्यूनतम मध्यम है जो मैग्नीशियम सल्फेट और आर्जिनिन (तालिका 1देखें) के साथ पूरक है। यह माध्यम अधिक मजबूत बायोफिल्म के गठन को उत्तेजित करता है।
- एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोटीटर डिश में अच्छी तरह से कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोल जोड़ें (तालिका 1देखें)। चूंकि ये परख आम तौर पर प्रत्येक तनाव के लिए ट्रिपलीकेट में किए जाते हैं, इसलिए प्रत्येक तनाव के 24 कुएं होने चाहिए।
- माइक्रोटिटर प्लेट को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
-
एंटीबायोटिक की एकाग्रता ढाल के लिए प्रीफेड बायोफिल्म को उजागर करना
- 7 कुओं के लिए एंटीबायोटिक की एक 10x कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें। उदाहरण: एंटीबायोटिक टोब्रामाइसिन के लिए, कुओं में अंतिम सांद्रता 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, और 0.006 मिलीग्राम /मिलीलीटर 5-8 हैं। 25 मिलीग्राम/मिलीलीटर के स्टॉक से, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, और 0.06 मिलीग्राम/मिलीलीटर के 10x कमजोर पड़ने की तैयारी करें। बर्फ पर छोड़ दें।
- मल्टीचैनल पिपेट (टेबल 1देखें) का उपयोग करके खर्च किए गए सुपरनेट (प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं युक्त) को हटा दें।
- सभी कुओं में 90 माइक्रोन M63 (Mg/Arg) जोड़ें।
- वांछित अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक 10x एंटीबायोटिक एकाग्रता के 10 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक दोहराने और तनाव के लिए अंतिम कुएं में 10 माइक्रोन पानी (कोई एंटीबायोटिक नियंत्रण) जोड़ें।
- माइक्रोटिटर प्लेट को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
-
मीडिया ताज़ा और जीवित कोशिकाओं की टुकड़ी के लिए अनुमति देता है।
- मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके खर्च किए गए सुपरनेट (प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं युक्त) को हटा दें।
- सभी कुओं में 115 माइक्रोन एम63 (मिलीग्राम/एआरजी) जोड़ें।
- माइक्रोटिटर प्लेट को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
-
जीवित कोशिकाओं के लिए परख।
- लेबल दो पौंड आगर प्लेटों प्रति ९६-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट ।
- 100% इथेनॉल में शूल को डुबोकर और एक बुनसेन बर्नर की खुली लौ में शूल को पारित करके मल्टीप्रोंग डिवाइस (तालिका1 देखें) को स्टरलाइज करें। दोहराना। शूल को थोड़ा ठंडा होने दें। मल्टीप्रोंग डिवाइस का उपयोग करके, माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक कुएं से एलबी एगर प्लेट की सतह तक प्लैंक्टोनिक संस्कृति के ~ 3 माइक्रोल (राशि जो आमतौर पर शूल के सुझावों पर बनाए रखा जाता है) स्थानांतरित करें।
- एलबी आगर प्लेटों को 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- एंटीबायोटिक की पहचान करके, आंखों द्वारा, बैक्टीरियल विकास के लिए कट-ऑफ(चित्रा 1)द्वारा न्यूनतम जीवाणु एकाग्रता निर्धारित करें।
2. एमबीसी-पी
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बैक्टीरियल उपभेदों की तैयारी
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक समृद्ध माध्यम में 16 घंटे के लिए ब्याज और उत्परिवर्ती तनाव के जंगली प्रकार तनाव की संस्कृति बढ़ें।
- एंटीबायोटिक प्रतिरोध परख के लिए ताजा माध्यम में संतृप्त रातोंरात संस्कृतियों 1:100 पतला । पी एरुगिनोसा के लिए एक मानक माध्यम M63 न्यूनतम मध्यम है जो मैग्नीशियम सल्फेट और आर्जिनिन (तालिका 1देखें) के साथ पूरक है।
- एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर डिश में अच्छी तरह से कमजोर पड़ने के 90 माइक्रोल जोड़ें (तालिका 1देखें)। चूंकि ये परख आम तौर पर प्रत्येक तनाव के लिए ट्रिपलीकेट में किए जाते हैं, इसलिए प्रत्येक तनाव के 24 कुएं होने चाहिए।
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एंटीबायोटिक की एकाग्रता ढाल के लिए प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को उजागर करना
- 7 कुओं के लिए एंटीबायोटिक की 10x कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें। उदाहरण: एंटीबायोटिक टोब्रामाइसिन के लिए, कुओं में अंतिम सांद्रता 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001, और 0.0005 मिलीग्राम/मिलीलीटर हैं। 25 मिलीग्राम/मिलीलीटर के स्टॉक से, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, और 0.005 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के कमजोर पड़ने की तैयारी करें। बर्फ पर छोड़ दें।
- वांछित अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक 10x एंटीबायोटिक एकाग्रता के 10 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक दोहराने और तनाव के लिए अंतिम कुएं में 10 माइक्रोन पानी (कोई एंटीबायोटिक नियंत्रण) जोड़ें।
- माइक्रोटिटर प्लेट को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
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जीवित कोशिकाओं के लिए परख।
- लेबल दो पौंड आगर प्लेटों प्रति ९६-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट ।
- 100% इथेनॉल में शूल को डुबोकर और एक बुनसेन बर्नर की खुली लौ में शूल को पारित करके मल्टीप्रोंग डिवाइस (तालिका1 देखें) को स्टरलाइज करें। दोहराना। शूल को थोड़ा ठंडा होने दें। मल्टीप्रोंग डिवाइस का उपयोग करके, माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक कुएं से एलबी एगर प्लेट की सतह तक प्लैंक्टोनिक संस्कृति के ~ 3 माइक्रोल (राशि जो आमतौर पर शूल के सुझावों पर बनाए रखा जाता है) स्थानांतरित करें।
- एलबी आगर प्लेटों को 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- आंखों से, बैक्टीरियल ग्रोथ(चित्रा 2)के लिए कट ऑफ की पहचान करके एंटीबायोटिक की न्यूनतम जीवाणु एकाग्रता निर्धारित करें।
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Representative Results
एमबीसी-पी और एमबीसी-बी परख किए गए थे, पीए14 वाइल्ड टाइप की संवेदनशीलता की तुलना पीए14 ∆एनडीवीबीके साथ की गई थी । टोब्रामाइसिन एंटीबायोटिक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। चरण 1.4.4(चित्रा 1)और चरण 2.3.4(चित्रा 2) केअनुरूप परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। पीए 14 और ∆एनडीवीबी को एमबीसी-पी और एमबीसी-बी में ट्रिप्लिकेट में टीका लगाया गया था । एमबीसी-बी प्रोटोकॉल के चरण 1.0-1.4 को पूरा करने और एमबीसी-पी प्रोटोकॉल के चरण 2.0-2.3 को पूरा करने के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं को एक एलबी आगर प्लेट पर चढ़ाया गया था। टोब्रामाइसिन(μजी/एमएल) की सांद्रता कोशिकाओं के बाईं ओर इंगित की जाती है। पीए14 के लिए एमबीसी-बी 100 μजी/एमएल और ∆एनडीवीबी के लिए एमबीसी-बी 12.5 μजी/एमएल है। पीए14 और ∆एनडीवीबी म्यूटेंट दोनों के लिए एमबीसी-पी 8 μजी/एमएल है ।
चित्रा 1. पीए14 जंगली प्रकार बनाम पीए14 ∆एनडीवीबी और टोब्रामाइसिन के साथ एमबीसी-बी परख से प्रतिनिधि परिणाम। मान टोब्रामाइसिन (μg/ml) की अंतिम एकाग्रता को संदर्भित करते हैं।
चित्रा 2। पीए14 जंगली प्रकार बनाम पीए14 ∆एनडीवीबी और टोब्रामाइसिन के साथ एमबीसी-पी परख से प्रतिनिधि परिणाम। मान टोब्रामाइसिन(μजी/एमएल) की अंतिम एकाग्रता को संदर्भित करते हैं।
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Discussion
प्लैंकटोनिक कोशिकाओं में एंटीबायोटिक प्रतिरोध कोशिकाओं (जैसे उत्परिवर्तन) में स्थायी परिवर्तन के कारण एंटीबायोटिक की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) में वृद्धि के रूप में परिभाषितकिया गया है। बायोफिल्म-विशिष्ट प्रतिरोध या सहिष्णुता के तंत्र जिन्हें आज तक पहचाना गया है, बायोफिल्म के भीतर जंगली प्रकार के जीन की अभिव्यक्ति का परिणाम हैं। इस प्रकार, प्रतिरोध की शास्त्रीय परिभाषा बायोफिल्म्स पर लागू नहीं होती है। हालांकि, परिभाषाओं का एक और सेट प्रस्तुत किया गया है: प्रतिरोध तंत्र एंटीबायोटिक को अपने लक्ष्य तक पहुंचने से रोकता है, जबकि सहिष्णुता तंत्र एंटीबायोटिक दवाओं के लक्ष्यों को बंद कर देता है10। बायोफिल्म-विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध तंत्र इन दोनों परिभाषाओं को शामिल करते हैं। शब्द "प्रतिरोध" इस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन आगे प्रयोग किया जाना चाहिए ताकि निर्धारित करने के लिए अगर एक जीन प्रतिरोध या सहिष्णुता के लिए योगदान दे रहा है ।
एमबीसी-पी और एमबीसी-बी परख को किसी भी बायोफिल्म बनाने वाले बैक्टीरियल स्ट्रेन और किसी भी जीवाणु रोधी एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस परख को अन्य बैक्टीरिया और अन्य रोगाणुरोधी एजेंटों के अनुकूल बनाने के लिए दो महत्वपूर्ण मानदंड उन स्थितियों का निर्धारण कर रहे हैं जो बायोफिल्म गठन का कारण बनते हैं और ब्याज के जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग करके रोगाणुरोधी एजेंट के लिए सांद्रता की उचित श्रृंखला का निर्धारण करते हैं। जॉर्ज ओ 'टूल9द्वारा प्रकाशित जोव बायोफिल्म निर्माण प्रोटोकॉल का उपयोग करके उचित बायोफिल्म-निर्माण स्थितियों का निर्धारण किया जा सकता है। एमबीसी-बी परख के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता सीमा निर्धारित करने के लिए, अंगूठे का एक अच्छा नियम 25 x MIC (न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता11)का उपयोग सीमा के मध्य एकाग्रता के रूप में करना और तदनुसार समायोजित करना है। एमबीसी-पी परख के लिए एमबीसी-बी परख के लिए पहचाने गए मानों के 1/10 का इस्तेमाल करें। लक्ष्य सांद्रता की एक श्रृंखला को परिभाषित करना है जो एमबीसी-बी के बीच जंगली प्रकार के तनाव और एक संवेदनशील उत्परिवर्ती तनाव के बीच स्पष्ट अंतर के लिए अनुमति देगा। इस प्रकार, रेंज के शीर्ष छोर जंगली प्रकार के तनाव के एमबीसी-बी के करीब होना चाहिए। हम इस प्रयोग को कम से कम तीन बार दोहराते हैं, जिससे न्यूनतम 9 डेटा अंक प्रति तनाव होता है।
इन परख का सबसे महत्वपूर्ण कदम संदूषण से बचने के लिए है। उपभेदों के बीच संदूषण को रोकने के लिए, उपभेदों के बीच एक खाली स्तंभ छोड़ा जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम मल्टीप्रोंग डिवाइस पर धातु शूल के लिए पर्याप्त समय पर्याप्त शांत करने की अनुमति है । यह शूल ज्वलंत, समय ठंडा अवधि और जल्दी से एक के हाथों से शूल को छूने से परीक्षण किया जा सकता है ।
यदि एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने के बाद बायोफिल्म से कोशिकाओं की टुकड़ी एक मुद्दा है, तो एमबीसी-बी विधि को एक सोनीशन चरण को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। ताजा मीडिया के अलावा के बाद चरण 1.3.3 (24 घंटे इनक्यूबेशन) छोड़ें। इसके बजाय, 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं को कवर करें ताजा मीडिया (चरण 1.3.2) के 115 माइक्रोलीटर को बाँझ चिपकने वाली प्लेट सील और सोनिकेट प्लेट के साथ जोड़ने के बाद कुओं की दीवारों से बायोफिल्म कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना। वाटर बाथ सोनिकेटर का इस्तेमाल करें। प्लास्टिक से बायोफिल्म कोशिकाओं को कुशल हटाने के लिए विशिष्ट शर्तों (समय, तीव्रता) को पहले से निर्धारित किया जाना चाहिए।
एमबीसी-बी की एक भिन्नता का उपयोग बायोफिल्म-विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध म्यूटेंट के लिए पी एरुगिनोसा के 4,000 ट्रांसपोसन-सम्मिलन म्यूटेंट की लाइब्रेरी को स्क्रीन करने के लिए किया गया था। टोब्रामाइसिन (50 माइक्रोग्राम/एमएल) की एकाग्रता को चुना गया था जो जंगली प्रकार की बायोफिल्म कोशिकाओं को नहीं मारेगा लेकिन उन म्यूटेंट की पहचान के लिए अनुमति देगा जो जंगली प्रकार बायोफिल्म की तुलना में 3 गुना अधिक संवेदनशील थे। बैक्टीरिया के एक विशिष्ट तनाव के साथ कुओं के स्तंभों को टीका लगाने के बजाय, प्रत्येक कुएं को एक अलग उत्परिवर्ती के साथ टीका लगाया गया था। म्यूटेंट को एक बायोफिल्म बनाने के लिए छोड़ दिया गया था, जो ५० μजी/एमएल टोब्रामाइसिन के संपर्क में था, टोब्रामाइसिन एक्सपोजर से उबरने के लिए छोड़ दिया गया था और फिर व्यवहार्यता के लिए परख लिया गया था । म्यूटेंट जो 50 μजीवित नहीं थे, उन्हें एक ही स्क्रीनिंग शर्तों के तहत पुन: परीक्षण किया गया था। एमबीसी-पी और एमबीसी-बी प्रोटोकॉल का उपयोग म्यूटेंट के टोब्रामाइसिन-संवेदनशील फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए किया गया था।
बायोफिल्म्स में एंटीबायोटिक प्रतिरोध को परखने के लिए अन्य तरीके हैं, यानी कॉलोनी बायोफिल्म्स और बायोफिल्म्स बायोरिएक्टर्स में उगाए गए12,13। इन तरीकों को काफी अधिक श्रमसाध्य और उपभेदों की संख्या में सीमित है कि आसानी से परख किया जा सकता है । इस प्रकार, एमबीसी-बी के पास इन अन्य तरीकों पर एक लाभ यह है कि यह उच्च-थ्रूपुट है, जिससे शोधकर्ता को स्क्रीन का संचालन करने या कई उपभेदों के साथ-साथ एक समय में कई अलग-अलग एंटीबायोटिक सांद्रता की अनुमति मिलती है।
| अभिकर् ता का नाम | अतिथि | सूची संख्या | टिप्पणियां (वैकल्पिक) |
| 1x M63 | 10 एल पानी में 15 ग्राम केएच2पीओ4, 35जी के2एचपीओ 4 और 10 ग्राम (एनएच4) 2 एसओ4को घोलकर5x एम63स्टॉक के रूप में तैयार करें। इस स्टॉक को ऑटोक्लेव करने की आवश्यकता नहीं है और इसे कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। पतला 5x स्टॉक 1:5, ऑटोक्लेव, शांत, फिर वांछित घटकों को जोड़ें। | ||
| केएच2पीओ4 | फिशर | पी285-500 | |
| कश्मीर2एचपीओ4 | फिशर | पी288-500 | |
| (एनएच4) 2 एसओ4 | सिग्मा | A5132 | |
| मैग्नीशियम सल्फेट | फिशर | M63-500 | 1 एमएमएम अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। पानी और ऑटोक्लेव में 1 एम स्टॉक के रूप में तैयार करें। |
| टोब्रामाइसिन | सिग्मा | 50 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक तैयार करें। Aliquot और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। | |
| आर्जिनिन | सिग्मा | A5131 | 0.4% अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। पानी में 20% स्टॉक के रूप में तैयार करें और स्टरलाइज करें। यह वैकल्पिक कार्बन/ऊर्जा स्रोत ग्लूकोज और कैसमिनो एसिड की जगह ले सकता है |
| 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटें | कॉर्निंग | 3595 | बाँझ, फ्लैट-बॉटम, कम वाष्पीकरण |
| ट्रैंफर्ट (मल्टीचैनल पिपेट) | ब्रांडटेक | 2703610 | 8-चैनल, 20-200 माइक्रोन |
| मल्टीप्रोंग डिवाइस | दान-कार | एमसी48 | ४८ शूल एक ९६-अच्छी तरह से माइक्रोटीटर प्लेट के 1/2 में फिट |
तालिका 1.
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Disclosures
लेखक घोषणा करता है कि उसके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक इस पांडुलिपि के साथ संपादकीय मदद के लिए ली झांग, जियान-झी ली, हारून हिंज और क्लेटन हॉल का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस परख शुरू में जॉर्ज ओ ' Toole, डार्टमाउथ में गीसेल स्कूल ऑफ मेडिसिन की प्रयोगशाला में विकसित किया गया था । डॉ माह की प्रयोगशाला में अनुसंधान कनाडा और सिस्टिक फाइब्रोसिस कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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