Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio's van de Adult knaagdierhersenen

Summary

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Abstract

Recent onderzoek toont aan dat het centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en het ontstaan ​​van tumoren gaat populaties van stamcellen (SC) ingezetene in de volwassen hersenen. Echter, de mechanismen die normaal rustende cellen gebruiken om de goede werking van neurale netwerken, alsook hun rol in het herstel van de schade en de beperking van neurodegeneratieve processen te waarborgen zijn weinig begrepen. Deze cellen verblijven aangeduid als "niches" dat een onderhoudende milieu door modulerende signalen van zowel de vasculaire en immuun systemen regio. De isolatie, onderhoud, en differentiatie van CNS SCs onder gedefinieerde kweekomstandigheden die onbekende factoren uit te sluiten, maakt ze toegankelijk zijn voor behandeling met farmacologische of genetische middelen, en geven zicht op hun in vivo gedrag. Hier bieden we gedetailleerde informatie over de methoden voor het genereren van culturen van CNS SC's uit verschillende regio's van de volwassen hersenen en benaderingen om hun d beoordelenifferentiation potentieel tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in vitro. Deze techniek levert een homogene celpopulatie een monolaag cultuur die kunnen worden gevisualiseerd individuele SC en hun nageslacht bestuderen. Bovendien kan het worden toegepast in verschillende diermodellen en klinische monsters, die eerder werden gebruikt voor regeneratieve reacties in de beschadigde volwassen zenuwstelsel voorspellen.

Introduction

Het centrale dogma van neurobiologie, door de fundamentele opmerkingen van de hersenen cytoarchitecture gemaakt door Ramón Y. Cajal meer dan een eeuw geleden gelegd, geoordeeld dat neurogenese onwaarschijnlijk was na de adolescentie gezien de complexiteit van de neurale netwerken in het CZS ^1. Hoewel de werkzaamheden van Altman in de jaren 1960 en later Kaplan, waaruit blijkt dat ^3H-thymidine kunnen worden gevonden in volwassen neuronen aangeeft dat daadwerkelijk neuronen werden geproduceerd in verschillende gebieden van de volwassen hersenen, het dogma bleef houden ^{2, 3.} Bewijs bleef te monteren met Nottebohm onderzoek beschrijft de seizoensgebonden veranderingen in het aantal neuronen aanwezig in zangvogel hersenen ^4. Het was niet tot 1999, toen Gould et al.. Gepubliceerde werk op de generatie van neuronen in de hippocampus neemt toe met de prestaties van associatieve leertaken in rat, evenals de opmerkingen van Kornack en Rakic ​​demonstratieting verder neurogenese in de volwassen makaak dat het begrip minder stijve, meer kunststof hersenen, werd erkend ^{5, 6.}

De zoektocht naar de cellulaire bron voor deze novo gegenereerde neuronen leiden tot de ontdekking van een discrete populatie van stamcellen (SC) dat in gebieden van de hersenen verblijven genoemd niches ^7. Subventriculaire zone sub korrelige gebied van de hippocampus worden beschouwd als de twee belangrijkste neurogene regio ^8,9 zijn. Cellen geïsoleerd uit deze locaties toont de klassieke kenmerken van embryonale of foetale afgeleide SC, zelfvernieuwing en differentiatie potentieel. Bij neurale stamcellen (NSC's), kunnen ze worden gedifferentieerd tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Bovendien, deze SC vlek positief voor foetale NSC merkers zoals het intermediaire filament eiwit nestine ^10. Meer recent werk benadrukt dat SC's niet kan worden beperkt tot deze two gebieden, en in feite gelokaliseerd door de hersenen als een grotendeels rustende populatie cellen stevig verbonden aan het vaatstelsel ^11.

De opmerkingen die SCS gemobiliseerd in reactie op letsel suggereert de mogelijkheid van het kunnen deze cellen te gebruiken voor regeneratieve doeleinden om te helpen bij het ​​herstel van neurodegeneratieve ziekte en beroerte ^{12, 13.} Dit is niet anders dan de rol die mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen bij de genezing van bindweefsel, die worden aangetroffen als perivasculaire cellen die het potentieel om osteoblasten, chondrocyten en vetcellen ¹⁴ geworden. Echter, NSCs niet op dezelfde wijze als MSCs geoogst uit beenmerg door routine aspiratie en dichtheidsgradiënt centrifugatie technieken en vervolgens gebruikt in autologe cellen gebaseerde therapieën. Bijgevolg andere bronnen van cellen, zoals het gebruik van foetale NSCs of neuronale precursors afgeleid van embryonic stamcellen zijn uitgebreid onderzocht in dierlijke ziekten en letsel modellen met wisselend succes ^15. Geïnduceerde pluripotente stamcel technologieën gebruik te maken van somatische cellen bronnen bieden een andere potentiële weg voor de productie van therapeutisch bruikbare cel-gebaseerde therapieën voor een breed scala van toepassingen, het overwinnen van de beperkte beschikbaarheid en ethische bezorgdheid over het gebruik van embryonale cellen en foetale weefsels ^16. Klinische vertaling van deze bevindingen blijkt een moeilijke taak, zoals gedemonstreerd in de strijd van de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen met SC-gebaseerde therapeutische benaderingen ^17,18, evenals een kronkelige baan regelgevende goedkeuring. Als alternatieve benadering kan invoering van specifieke farmacologische behandelingen NSC nummers moduleren en herstel van de ziekte van Parkinson en beroerte ¹⁹ vergemakkelijken. Ongeacht de strategie kan worden, begrijpen hoe ze effectief te manipuleren deze cellenvereist een toegankelijk in vitro systeem.

Culturen van NSCs kan worden uitgevoerd als aggregaat culturen, ook bekend als neurosferen, of een monolaag ^8,20. Beide technieken zijn op grote schaal gebruikt, waardoor de vestiging van bepaalde kweekomstandigheden, dwz gebruik van epidermale groeifactor (EGF) of basische fibroblast groeifactor (bFGF) als een mitogeen bron, die voorzien in de uitbreiding van multipotente voorlopers. Terwijl neurosfeerculturen beter geschikt voor het bestuderen van klonale vermeerdering vermogen van een geïsoleerde celtype zijn, is het systeem getoond om een gemengde populatie van cellen tijdens de expansie ^21. Bovendien, de gesloten structuur neurosferen maakt farmacologische manipulatie van de cellen onpraktisch en de interpretatie van deze factoren invloed kunnen hebben kunnen verward worden door de in de neurosphere zich gevestigd micromilieu. Monolaagkweken, anderzijds, kanwerkzaam in high throughput-schermen van kleine molecule bibliotheken, die een krachtig hulpmiddel om de signaaltransductie mechanismen die SC groei en differentiatie regelen en opent de mogelijkheid om nieuwe verbindingen die specifiek deze cel bevolking ontdekken verkennen.

Bijgevolg kan de mogelijkheid om reproduceerbaar genereren kweken van volwassen NSCs uit verschillende gebieden van belang in de hersenen worden gebruikt in een breed spectrum van wetenschappelijke toepassingen, variërend van ontwikkelingsstudies van het centrale zenuwstelsel (CZS) te onderzoeken van nieuwe regeneratieve geneeskunde benaderingen . De hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te ontleden en de differentiatie potentieel van CNS SC's geïsoleerd van de volwassen knaagdierhersenen beoordelen.

Protocol

Het werk houdt zich aan de Verklaring van Helsinski en de ARVO Animal Statement. De dieren werden gebruikt voor weefselverzameltoestel en alle relevante werkwijzen werden gevolgd volgens de instructies van de dierfaciliteit bij de Universiteit van Dresden. De dieren werden behandeld en gehuisvest in overeenstemming met de Duitse richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van proefdieren, en de studie werd goedgekeurd door de Landesdirektion Dresden. Neem contact op met het veterinaire beleid van uw instelling (IACUC of ander board) met betrekking tot geschikte euthanasie methodologie.

Specifieke voorraad en concentraties van de reagentia kan worden gevonden in het reagens de tabellen bij dit protocol.

1. Cultuur gerecht Voorbereidingstijd

1. Coat gerechten met een voldoende volume van 75 ug / ml poly-L-ornithine (dwz 2 ml / putje van een 6-wells plaat) 's nachts in de celkweek incubator 2 dagen voor de geplande datum dissectie.
2. Verwijder de laatste wasbeurt, voeg dan fibronectine (verdund 1:250, 4 ug / ml in PBS) aan de plaat en plaats de gerechten in de incubator 's nachts.
3. Zuig het fibronectine op de dag van dissectie en de afwas 2x met PBS. Keer de platen nog steeds met de laatste PBS wassen om de couveuse totdat de gedissocieerde weefsel is klaar voor het kweken. Op dat moment, verwijder de PBS voorafgaand aan het weefsel plating.
4. WINKEL platen bekleed met poly-L-ornithinein incubator voor maximaal 3 weken. Platen gecoat met fibronectine kan worden bewaard tot 1 week. Fibronectine coating kan in slechts 2 uur worden gedaan als dringend. Fibronectine is gevoelig voor denaturatie, hoeft de oplossing niet schudden of laten vaat drogen.

2. Dissectie / Plating

1. Dit protocol geldt voor het gebruik van 3 volwassen ratten (3-6 maanden).
2. Chill de hersenen snijden blok op ijs voorafgaand aan euthanasie de rat.
3. Plaats een 15 ml Falcon buis die 5 ml N2 medium met toegevoegde bFGF op ijs bevat.
4. Euthanaseren de ratten volgens het veterinaire beleid van uw instelling.
5. Verwijder de hersenen uit de schedel door het maken van een incisie langs de middellijn van het hoofd. Gebruik een tang om afpellen het bot waardoor de hersenen zorgvuldig worden geëxtraheerd.
6. Plaats de hersenen in een 10 cm petrischaal met ijskoude PBS. Dit zal eventueel resterende haren en bloed te verwijderen. (Figuur 1A)
7. Plaats de hersenen in de gekoelde snijden blok. (Figuur 1B)
8. Steek een nieuwe schone scheermesje in het blok zoals afgebeeld in figuur 1C.
9. Plaats een tweede schoon scheermesje 3 mm caudaal van de eerste zie figuur 1D.
10. Til de messen uit het blok, met medeneming van de sectie van belang.
11. Float de secTION uit het blad door onderdompeling in PBS. (Figuur 1E)
12. Oogst weefsel van het gebied van belang (in dit voorbeeld gebruikten we de commissura anterior (voorste) ACA, Figuur 1F) met # 5 pincet en verzamelen in een 15 ml conische buis met 1 ml N2 medium met bFGF.
13. Zet de buis in een laminaire stroming celkweek kap, waarmee de rest van het protocol onder steriele omstandigheden.
14. Mechanisch distantiëren het weefsel met behulp van een 1 ml pipet tip bevestigd aan een P1000 pipet. Pipet op en neer meerdere malen (ongeveer 20x met een snelheid van pipetteren 1 cyclus per seconde) terwijl u de opening van de pipetpunt tegen de onderzijde van de conische buis (fig. 1G 1-3). Stop wrijven wanneer de oplossing homogeen.
15. Laat de oplossing te zitten voor 2 minuten zodat de nog grotere nondissociated weefsel om naar de bodem. (Figuur 1G 4)
16. Verzamel de homogenexportgerichte bedrijven supernatant en te plaatsen in een conische buis met 8,5 ml N2 media plus 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2, en 200 nMJAK Inhibitor.
17. Plaat ze in 3 putjes van een 6-wells plaat met behulp van 3 ml verdund cel oplossing / goed.
18. Plaats de plaat in een bevochtigde cel incubator bij 37 ° C, 5% _CO2, 5% _O2.

3. Daily Care

1. Vervang het medium op de cultuur gerechten met N2 medium dat bFGF, Ang2, Dll4 en JAK remmer 24 uur na plating.
2. Voeg een bolus van bFGF, Dll4, Ang2 en JAK-remmer op de volgende dag.
3. Herhaal dit afwisselend proces van media veranderingen en toevoegingen factor voor een totaal van 10-14 dagen.

4. Inductie van differentiatie

1. Trekken bFGF, Dll4, Ang2 en JAK remmer bevattend medium en te vervangen door N2 medium dat eventuele extra factoren bevat.
2. Verander elke tweede dag het medium.
3. Fixeer de cellen na 10 dagen en immunocytochemie voeren.

5. Immunocytochemische Detectie

1. Zuig het medium en bevestig celkweek platen met 2 ml van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten.
2. Wassen met 2x 3 ml PBS gedurende 5 minuten elk.
3. Zuig PBS, vervolgens doorlaatbaar en blokkeren de cellen door toevoeging van 2 ml PBS met 5% normaal serum ezel (NDS) en 0,1% Triton X-100 gedurende 20 minuten.
4. Bereid het primaire antilichaam mix PBS met 5% NDS. Anti-nestine antilichaam kan worden gebruikt voor het identificeren SC, terwijl TUJ1 (klasse III β-tubuline), GFAP en CNPase antilichamen kunnen samen gebruikt worden voor een drievoudige kleuring van differentiatie merkers.
5. Zuig het blockingbuffer en voeg 1,5 ml van het primaire antilichaam mengsel aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten.
6. Verwijder de primaire antilichamen en was 2x met 3 ml PBS en 1x met 3 ml PBS met 5% NDS gedurende 5 minuten elk.
7. Prepare de secundaire antilichamen in PBS met 5% NDS.
8. Zuig het laatste wassing en voeg 1,5 ml secundair antilichaam oplossing in elk putje. Incubeer in het donker gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
9. Verwijder het secundaire antilichaam oplossing en 2 ml van een vers bereide DAPI kleuring (500 ng / ml in PBS). Incubeer gedurende 3 minuten.
10. Zuig het DAPI oplossing was daarna 3x met 3 ml PBS gedurende 5 minuten elk. De cellen kunnen nu worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop.

Representative Results

Het identificeren van de regio van belang om uit te neurale stamcellen te oogsten is de belangrijke eerste stap en zal de hoeveelheid tijd die het duurt om een ​​samenvloeiing plaat van cellen krijgen definiëren. Bijvoorbeeld, de SVZ is een klassiek neurogene stippellijn daarom een ​​hogere relatieve verhouding van neurale stamcellen. Echter, de hier gepresenteerde techniek worden gebruikt met andere regio's vaak niet erkend als robuust neurogene mogelijk tijdens de volwassenheid. Voor de toepassing van dit protocol, gebruikten we de commissura anterior (voorste deel). Hoewel sommige van de cellen en afval zal regelen na plating, zal het medium gewoonlijk troebel blijft als gevolg van de hoeveelheid celmateriaal dat aanwezig volgt trituratie. De eerste mediumverversing op 24 uur zal de meerderheid van deze te verwijderen. Zoals zichtbaar gemaakt door lichtmicroscopie, zal blijken er een grote hoeveelheid celmateriaal blijven, samen met bloedvaten, zelfs na de eerste mediumverversing. In de loop vanDe komende dagen zal kolonies van een afzonderlijke prolifererende celpopulatie zichtbaar worden onder de microscoop (Figuur 2A). Dit zijn de neurale stamcellen die zijn geselecteerd op groei door middel van N2-medium dat bFGF, Ang2, Dll4 en JAK-remmer. Daarnaast kan een langwerpig spindel-achtige celpopulatie aanwezig (Figuren 2B en zijn   C). Dit zijn geen neurale stamcellen (waarschijnlijk radiale glia gebaseerd op morfologie en vlekken), zullen ze uiteindelijk worden ingehaald door de snellere delende neurale stamcellen bevolking. In de loop van een week tot 14 dagen zullen de cellen dichter worden totdat zij confluentie (figuur 2D) te bereiken. Deze culturen vlek positief voor een aantal stamcel markers, waaronder Nestin, Hes3 en Sox2. (Fig. 2E-H), waardoor het vertrouwen dat de celpopulaties die geselecteerd en uitgebreid inderdaad neurale stamcellen.Verdere bevestiging komt van de mogelijkheid tot terugtrekking FGF uit het medium, waardoor de cellen differentiëren gedurende 10 dagen tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten (fig. 2I) genereren.

Figuur 1: Isolatie van hersenen van de rat secties voor neurale stamcellen oogsten volwassene. A) Volwassen hersenen van de rat na het wassen met PBS. B) Rat hersenen geplaatst in een gekoeld roestvrij staal snijden blok. C) bij benadering positionering van de eerste scheermesjes binnen het blok te coronale secties van de hersenen. D) Plaatsing van 2 extra scheermesjes produceren in het snijden blok. Noot, werden dunner tweesnijdend messen gebruikt voor demonstratiedoeleinden zodat voor eenvoudiger visualisatie van de sitingen in het blok. E) coronale hersenen secties die gebieden. F) Schematische weergave van de Paxinos hersenen atlas aandacht voor de subventriculaire zone als een klassieke neurogene regio, en de voorste commissuur uit welke cellen voor dit protocol werden geoogst te worden geoogst. G) opeenvolgende beelden van het weefsel dissociatie proces met behulp van een 1 ml pipet tip bevestigd aan een P1000 micropipettor. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2: Adult neurale stamcellen in vitro. A) Volwassen neurale stamcellen kweek na een week. B) Voorbeelden van een brede spindel morfologie cellen (red pijlen) af en toe aanwezig in de culturen die niet neurale stamcellen. C, D) Onder de kweekomstandigheden in dit protocol, de neurale stamcellen bij voorkeur EH uitbreiden.) Expressie van neurale stamcellen markers volgende 14 dagen in vitro, Sox2 (groen) (E), Hes 3 (rood) (F), en Nestin (violet) (G). I) Differentiatie van neurale stamcellen tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Na mitogeen terugtrekking werden de cellen mogen differentiëren voor 10 dagen, daarna immunostained voor GFAP (groen), TUJ1 (rood), en CNPase (blauw). J) Hes3 immunokleuringen bij volwassen hersenen van de rat. Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

Veel van de kritische stappen succesvolle isolatie, expansie en differentiatie van neurale stamcellen uit volwassen hersenen worden gedeeld gemeen met standaard weefselkweektechnieken. De doelstelling om in gedachten te houden is dat NSCs geïsoleerd van de volwassen hersenen als veel van hun in vivo eigenschappen mogelijk (Figuur 2J) moet blijven. Vaak een evenwicht tussen noodzakelijke voorzichtigheid en gepaste snelheid moet worden gevonden. Zorg met de isolatie van de hersenen uit de schedel zal de identificatie van de regio van belang een stuk gemakkelijker maken. Weefsel verwijderen zo snel mogelijk na dier euthanization en houden de hersenen koud tijdens het oogsten en wassen blijft het stijver en meehelpt bij de behandeling van het weefsel wanneer het wordt geplaatst in de roestvrijstalen matrijs snijden. Dit minimaliseert ook het potentieel voor het rippen van het weefsel tijdens het snijden. Het protocol profiteert ook van zijn able om de cellen aan het punt van snel plating, aangezien dit verhoogt cellevensvatbaarheid als ze in vitro worden geplaatst. Juiste weefsel wassen vóór snijden helpt ook het potentieel van verontreiniging in de kweken te verminderen. Tijdens het dissociatieproces moet wrijven met een 1 ml pipet krachtig, maar op een manier overmaat luchtbellen of opschuimen van de celsuspensie die een negatieve invloed celoverleving niet te genereren. De eerste mediumverversing is cruciaal omdat de meeste nonattached cellen en cellulair afval die ontstaat door het weefsel dissociatie proces dat factoren die schadelijk zijn voor de overleving van de eerste stamcellen bevolking bevat verwijdert. Voor een betere visualisatie volgende immunokleuring kunnen de vers geïsoleerde cellen worden uitgeplaat op 25 mm dekglaasjes geplaatst in de bodem van de 6-well platen. De concentraties van poly-L-ornithine en fibronectine in coating mag worden verhoogd tot 500 mg / ml en 20 μg / ml. Als alternatief kunnen meerdere kleinere dekglaasjes (bijvoorbeeld 12 mm) worden geplaatst in elk putje. Deze kunnen dan worden verwerkt voor het onafhankelijk immunokleuring in afzonderlijke putjes van een 24-well plaat, afbouw de hoeveelheden kleurstoffen gebruikt om rekening te houden met de kleinere volumes. De dekglaasjes worden vervolgens gemonteerd op objectglaasjes met een standaard waterig fixeermiddel.

Het definiëren van de aanwezigheid van NSC in de volwassen hersenen is van groot belang op het gebied van de neurobiologie. Er zijn twee algemene benaderingen om stamcellen te identificeren. In een, kan een set van biomarkers op basis van een gen-expressie profiel van de stamcel populatie in kwestie worden gebruikt om de afbeelding hun door immunohistochemie. Vanuit experimenteel eenvoudig, geeft geen functionele gegevens, noch bepaalt of de cellen de fundamentele eigenschappen van stamcellen, die zichzelf vernieuwen of differentiëren in meerdere verschillende celtypes. In de andere benadering worden cellen geïsoleerd in either een zuiver of heterogene populatie, geplaatst in cultuur, en er zelfvernieuwing en multipotentiële eigenschappen worden beoordeeld aan de hand van de levende cel bevolking. Deze benadering geeft functionele gegevens, en kan worden gebruikt om ondubbelzinnig bewijs "stemness" in deze bijzondere in vitro experimentele omstandigheden. Echter, de problemen met het onderhoud van deze cellen in kweek deze tweede functionele benadering belemmerd. In feite, is het onvermogen om NSCs groeien uit andere gebieden van de hersenen de indruk dat er slechts een paar gespecialiseerde niches waar zij verblijven vertrokken.

De hier gepresenteerde methode maakt het kweken van NSCs van veel verschillende gebieden van het CNS. Deze techniek is gebaseerd op ons werk dat een signaaltransductieroute groot belang toegelicht aan de controle het aantal NSCs zowel in vitro als in vivo. De factoren die in dit protocol werden geselecteerd op basis van uitgebreide signaaltransductie studies, Waaruit blijkt dat zij bevorderen NSC groei via een gemeenschappelijke transcriptiefactor Hes3. Onze eerdere studies tonen dat dit combinatie leverde een nog grotere toename in NSK aantallen vergeleken met het gebruik ervan afzonderlijk. De keuze van welke farmacologische ondersteuning wordt toegevoegd aan de kweek moet worden gezien in de context van de biologie onderzocht. Bijvoorbeeld, terwijl zowel Ang2 en Dll4 hebben een positieve invloed op NSC groei, ze hebben tegengestelde effecten op het vaatstelsel van de vorming van ^22,23. Door verdere optimalisatie van de kweekomstandigheden, zal extra nieuwe biomarkers voorbij Hes3 waarschijnlijk worden geïdentificeerd en uitbreiden van het erkende aantal NSCs in de volwassen hersenen nog verder. Dit wordt geïllustreerd door onze waarnemingen die scheidingen tussen de Hes3 + celpopulatie uit verschillende hersengebieden kunnen worden gemaakt. Bijvoorbeeld Hes3 + cellen van het ruggenmerg, zoals die van de SVZ en ACA, tonen een aantal voudige toename van het aantal indien gekweekt met dezefactoren. Bovendien kunnen Hes3 + cellen van al deze gebieden efficiënt genereren neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. De morfologie en genexpressie van de gedifferentieerde celtypes is niet identiek. Extra biomarkers die onderscheid maken tussen verschillende Hes3 + celtypes zal een welkome aanvulling op het veld. De hier gepresenteerde methode waardoor de efficiënte productie van NSC kweken kunnen worden gebruikt als een instrument om dit doel.

Net als de NSC markers nestine en Sox2, de transcriptiefactor Hes3 identificeert een cel bevolking die op de isolatie kan worden gekweekt in vitro als onderscheiden in de belangrijkste celtypes die het zenuwstelsel, neuronen, astrocyten en oligodendrocyten ¹¹ vormen. Echter, in tegenstelling tot deze meest gebruikte merkers, Hes3 identificeert ook zwakke NSC, bijgevolg, veel Hes3 + cellen geen indicatoren mitose ⁽³ H-thymidine of BrdU) bevatten onder homeostatische caarden (en dus hebben klassieke detectietechnieken vermeden). Toepassing van de hier beschreven protocol was onmisbaar bij de ontdekking van deze NSC populatie. Het aantal van deze cellen toeneemt in kweek bij behandeling met factoren uit het vasculaire endotheel, zoals de Notch-ligand Delta4 en Angiopoetin2 overeenkomstig hun perivasculaire lokalisatie in vivo ^24.

Met directe toegang tot deze cellen geïsoleerd uit volwassen hersenen maakt experimenten te onderzoeken hoe de cellen reageren op signaaltransductie niveau verschillende factoren, en biedt een aantal predictieve aangegeven hoe de cellen reageren vivo. Verder kijken dan de regeneratieve geneeskunde, hebben we aangetoond dat de kweekomstandigheden hier beschreven hebben relevantie voor kankeronderzoek ook. Zij beter vertegenwoordigen de omgeving die kanker stamcellen geïsoleerd van glioblastoma multiforme ervaring, terwijl in de patiënt, waardoor de studie of signaalwegen die kunnen worden gemanipuleerd om tegen hun groei ^30. De brede toepassing van deze techniek zou grote gevolgen hebben voor meerdere aspecten van onderzoek en geneeskunde hebben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit