Summary
la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.
Abstract
La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des principales niches neurogène dans le cerveau postnatal. Ici, cellules progénitrices neurales prolifèrent et donnent lieu à des neuroblastes capables de se déplacer le long de la courant de migration rostrale (RMS) vers le bulbe olfactif (OB). Cette migration de longue distance est nécessaire pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones dans l'OB, mais les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus sont encore peu claires. Enquêter sur les voies de signalisation contrôlant neuroblastes motilité peut non seulement aider à comprendre une étape fondamentale dans la neurogenèse, mais aussi avoir un potentiel de régénération thérapeutique, compte tenu de la capacité de ces neuroblastes de cibler des sites cérébrales affectées par une blessure, accident vasculaire cérébral, ou dégénérescence.
Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé pour in vivo électroporation postnatal et après imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le RMS de la souris. Électroporation postnatale peut efficacement transfecter SVZ ancêtrecellules, qui à leur tour, les neuroblastes qui migrent le long des RMS. Confocale disque en rotation time-lapse microscopie sur des cultures de tranches de cerveau de courte durée, la migration des neuroblastes peut être contrôlée dans un environnement ressemblant étroitement à la condition in vivo. En outre, neuroblaste motilité peut être suivi et analysé quantitativement. A titre d'exemple, nous décrivons comment utiliser in vivo postnatale électroporation d'un plasmide exprimant la GFP d'étiqueter et de visualiser les neuroblastes qui migrent le long des RMS. L'électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant chez la souris knock-out conditionnel qui emploient le système de LoxP peut également être utilisé pour cibler des gènes d'intérêt. Manipulation pharmacologique des cultures de tranches de cerveau aiguë peut être effectuée pour étudier le rôle des différentes molécules de signalisation dans la migration des neuroblastes. En couplant électroporation in vivo avec imagerie time-lapse, nous espérons comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la motilité neuroblastes et contribuer au développementment de nouvelles approches pour favoriser la réparation du cerveau.
Introduction
Dans le cerveau des mammifères, la génération de nouveaux neurones (neurogenèse) commence après la naissance principalement dans deux régions, la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire dans le gyrus denté de l'hippocampe 1. Des preuves considérables recueillies au cours des dernières années prend en charge un rôle essentiel pour la neurogenèse postnatale dans les fonctions de mémoire de l'ampoule de l'hippocampe et olfactives 1-3. Surtout, la neurogenèse postnatale est également titulaire d'un potentiel thérapeutique en raison de sa relation avec les troubles neurologiques dégénératives, et la capacité des neuroblastes à migrer vers les sites blessés dans le cerveau 4-6.
La zone sous-ventriculaire (SVZ) a récemment émergé comme une niche neurogène crucial. Neuroblastes SVZ dérivés migrent vers le bulbe olfactif (OB) via le courant de migration rostrale (RMS), ce qui en fait le plus long processus de migration dans le cerveau 1,7,8 postnatale. Le / RMS / système de OB mammifère SVZ est devenu unmodèle utile pour étudier les différentes étapes de la neurogenèse, tels que la prolifération, la migration et la différenciation 1,8. Beaucoup de facteurs de croissance et signaux extracellulaires régulent la neurogenèse SVZ et migration le long des RMS, mais les mécanismes moléculaires intracellulaires sont loin d'être pleinement compris 1,9. Migration correcte le long des RMS est essentiel pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones 10. En outre, certaines études ont montré que les neuroblastes SVZ dérivés peuvent migrer hors des RMS aux sites de lésions cérébrales 4-6,11-13. Ainsi, l'enquête de la migration des neuroblastes mécanismes de signalisation de régulation est fondamental non seulement pour comprendre la neurogenèse, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour marquer progéniteurs neuronaux SVZ par électroporation postnatale in vivo et de suivre leur migration le long des RMS dans les cultures de tranches de cerveau de courte durée en utilisant time-lapse disque rotatif confocale microscopy. L'électroporation est largement utilisé dans les études de développement de l'embryon à stade adulte 14-18. Il est un outil puissant pour cibler et manipuler progéniteurs neuronaux SVZ et représente une alternative moins coûteuse et beaucoup plus rapide à l'injection stéréotaxique de vecteurs viraux ou génération de modèles transgéniques 1,15,19,20. Il s'agit d'un procédé relativement simple qui ne nécessite pas une intervention chirurgicale et a des taux de survie élevés. Électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant dans les modèles génétiques de souris qui emploient le système loxP peut être utilisé pour cibler des gènes d'intérêt ou de réaliser l'étiquetage permanent des progéniteurs SVZ, ce qui représente un outil utile pour les études de la neurogenèse adulte 21,22.
Imagerie RMS migration des neuroblastes dans le cerveau intact est encore difficile en raison de limitations techniques actuelles. Toutefois, ce processus peut être contrôlé à l'aide confocale à disque rotatif time-lapse microscopie de tranches de cerveau de courte durée, qui fournissent un syst appropriélui ressemblant étroitement à la condition in vivo aussi prêtent à la manipulation pharmacologique 23,24. Couplage dans électroporation postnatale vivo avec imagerie time-lapse facilitera la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant neuroblastes motilité et contribuer au développement de nouvelles approches pour promouvoir la réparation du cerveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cette procédure est conforme à Accueil Règlement Royaume-Uni bureau (ACT des procédures scientifiques des animaux, 1986). Les scientifiques doivent suivre les lignes directrices établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animaux institutionnelles et nationales.
Une. Postnatale électroporation
1.1. Préparation de verre capillaires, de l'ADN de solutions et Electroporator
- Préparer des capillaires de verre tiré (DO: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) pour l'injection d'ADN. (Paramètres indicatifs pour un capillaire extracteur Sutter P-97 sont: chaleur 283; Tirer 50; Velocity 90; heure 50). Faire une marque sur le capillaire correspondant à un volume d'environ 2 pl.
- Régler la tension de la électroporateur à 5 impulsions carrées, 50 ms / impulsion à 100 V, avec 850 intervalles ms (100 V, impulsion ON 50 ms, impulsion OFF 850 ms, impulsion 5).
- Diluer à haute pureté (DO 260/280> 1,80) de l'ADN plasmidique à l'endotoxine libre à une concentration finale de 1 à 2 ug / ulavec une endotoxine libérer un tampon Tris-EDTA ou du PBS. Il est recommandé d'ajouter 0,1% de vert de production rapide de la solution d'ADN (le colorant doit se propager dans le ventricule lorsqu'il est injecté avec succès).
- Préparer les électrodes 5-7 mm, le gel de l'électrode et réchauffer le coussin chauffant.
1.2. Électroporation
- Suppression d'un jour 2 chiot postnatal de la souris de cage et anesthésier par inhalation d'isoflurane (à un débit de ~ 0,6 L / min).
- Après environ 1 minute, de déterminer l'état de l'anesthésie à l'aide de la réponse du pied presseur. Si aucun mouvement n'est détecté, procéder à l'injection intraventriculaire.
- Charger aiguille capillaire avec 1-2 pl de l'ADN en utilisant un tube d'aspiration relié au tube capillaire.
- Sous une source de lumière froide, tenir la tête du chiot entre le pouce et l'index de votre main moins dominante. Tirez légèrement la peau du dos de la tête pour aider à l'identification du point d'injection à droite.
- Considérons une ligne virtuelle entre l'œil et til craniométriques repère lambda (figure 1A). Insérer l'aiguille capillaire à environ un tiers de la longueur de cette ligne à partir de la lambda (environ 1 mm à partir du point médian de la ligne 15). Insérer le capillaire sur 2 mm de profondeur, en veillant à éviter une pénétration profonde dans le cerveau.
- Injecter lentement plasmide par soufflage à travers la bouche (une seringue connectée au capillaire peut également être utilisé). Au cours de cette procédure, assurez-vous que vos doigts ne sont pas appliquer trop de pression sur le cerveau, car cela peut empêcher l'injection de plasmide succès.
- Arrêter l'injection lorsque la quantité minimale de solution d'ADN est laissé dans le capillaire. Il est recommandé d'injecter à moins de 1 ul d'éviter l'augmentation de la pression intracrânienne délétère.
- Manteau deux électrodes avec du gel et placez-les avec le côté positif sur la face latérale de l'hémisphère où l'ADN a été injecté (figure 1A). Pour l'incorporation d'ADN dans la SVZ rostrale, place des électrodes peu rostrale à lapoint d'injection. Faire varier la position de l'électrode peut obtenir une spécificité régionale de l'électroporation dans différents domaines de la SVZ 22,25.
- Initier le transfert en cours en appuyant sur la pédale impulsion de pédale. Lorsque l'électroporation est terminée, vérifier la tension sur l'écran de électroporateur (valeurs de tension ne doit pas être inférieure à 90 V, car les valeurs de tension plus faible corrélation avec une faible efficacité d'électroporation).
- Réanimer le chiot sous oxygène sur coussin chauffant pendant quelques minutes et le retourner à la cage, le plaçant loin de la mère. Assurez-vous que la mère récupère le chiot et réunit avec le reste de la litière. Après électroporation, laissez les petits avec leur mère pendant 4-7 jours avant l'étape suivante.
2. Préparation des cultures aiguë tranche cerveau
2.1. Préparation des solutions et outils
- Les solutions suivantes sont nécessaires (il est également possible d'utiliser-DMEM riche en glucose pour disséquer et d'imagerie17):
Dissection Medium (500 ml)
Médias équilibrée de Gey - 500ml
45% Glucose - 5ml
Film moyen (10 ml)
45% de glucose - 0.110 ml
HEPES 1 M - 0,100 ml
Pen / Strep - 0.100 ml
FCS - 0.500 ml
B27 - 0.100 ml
Glutamine - 0,200 ml
Dulbecco Modified Eagle Medium (rouge de phénol libre) - 8,89 ml - Réchauffez milieu de film à 37 ° C.
- Placez Millicell insère dans un fond plat de la culture 35 mm de verre contenant 1 ml de milieu de film et placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2.
- Préparer vibratome accessoires (tournevis, chambre, lames de rasoir, de la colle).
- Préparer les outils de dissection: ciseaux, petite spatule, pinces droites.
- Préparer les outils pour la manipulation de tranches: petit pinceau doux ou anse (taille: 10 pi), pipettes Pasteur en plastique, une boîte de glace et plusieurs plats en plastique 6 cm.
- Prérefroidir le milieu de dissectionà 2-4 ° C.
2.2. Préparation des tranches de cerveau
- Remplir un plat de 6 cm avec un milieu de dissection pré-refroidi et placez-le sur la glace (pour garder des tranches fraîchement coupées).
- Après la dislocation cervicale, utiliser des ciseaux pour décapiter le chiot de la souris. Retirez le cuir chevelu avec un scalpel, couper le crâne long de la suture mi-sagittal de l'OB pour le cervelet et retirez délicatement les volets crâniens aide d'une pince. Assurez-vous que l'ensemble du cerveau est exposé et soigneusement disséquer à l'aide d'une spatule, en prenant soin de ne pas endommager le tissu. La dissection doit être fait avec soin, mais en même temps très rapidement (moins d'une minute si possible). Dislocation cervicale est notre méthode préférée, car l'anesthésie terminaux avec des anesthésiques médicaments / de gaz peuvent influencer les propriétés de migration des neuroblastes et l'état de santé des cultures tranche de cerveau, qui doivent être imagé relativement rapidement après le sacrifice animal.
- Hemisect le cerveau avec un razou lame (Figure 2). Jeter hémisphère non injectée ou à d'autres expériences.
- Placer un petit morceau de ruban adhésif sur le support de vibratome et utiliser la quantité minimale nécessaire de la colle pour fixer l'hémisphère du cerveau au-dessus de celui-ci (figure 2). Ceci permet d'éviter d'endommager la surface de support à des applications répétées en raison de la colle.
- Laissez la colle sécher pendant quelques secondes.
- Placez support dans le bac vibratome rempli de solution de dissection pré-refroidi. Pointer le bulbe olfactif vers la lame (Figure 2).
- Commencez à couper l'hémisphère du cerveau en utilisant les paramètres appropriés. Les paramètres suivants sont recommandés: épaisseur de la tranche 300 um; vitesse ~ 3-5, la fréquence ~ 9. Haute fréquence et basse vitesse sont recommandés pour éviter d'endommager la tranche.
- Recueillir tranches à l'aide d'un petit pinceau ou une anse doux. Ne garder que les tranches avec OB visible (habituellement 2-3 tranches / cerveau). Typiquement, la tranche contenant la plupart des RMS can se trouve à ~ 300 um de la surface inférieure.
- Vérifiez tranches sous un microscope fluorescent standard pour le signal de la GFP (en prenant soin de les retourner pour vérifier fluorescence des deux côtés), et choisir celles montrant la fluorescence lumineuse le long de la plupart des RMS.
2.3. La culture de tranches de cerveau
- Dans une hotte de culture cellulaire, couper la troisième plus caudale de la tranche de cerveau et enlever toute trace de colle en utilisant une pince à épiler droites fines ou un scalpel de microdissection.
- Délicatement aspirer la tranche à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique (couper la pointe de la pipette pour créer une plus grande ouverture, ce sera de ne pas endommager la tranche) et le placer sur le centre d'un Millicell préchauffé insert.
- Assurez-vous que le côté avec le signal fluorescent lumineux est placé en contact avec le Millicell insérer (pour l'imagerie avec un microscope inversé).
- Retirer la solution de dissection excès au-dessus de l'insert avec une pipette.
- Laissez cultures tranche des'installer dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 1 h avant l'imagerie.
3. Imagerie time-lapse de la migration neuroblaste
- Au moins 2 heures avant l'imagerie, allumez le système Perkin Elmer UltraViewVoX confocale à disque rotatif, inversé Nikon Ti-E microscope, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) caméra CCD refroidie numérique, et le système de chauffage (Solent scientifique) fixé à la constante température de 37 ° C.
- Ouvrez le module d'acquisition de logiciels de Volocity et cliquez sur le bouton "Viz" et sélectionnez le laser (s) pour l'imagerie.
- Dans 2 heures de cerveau préparation de tranches, placez le plat de fond de verre contenant la tranche de cerveau dans la chambre d'imagerie sur la platine du microscope.
- Utilisez un objectif Nikon FCI super plan Fluor ELWD 20X/0.45 sous la lumière fluorescente approprié de choisir et de se concentrer le domaine de la tranche qui sera imagée (par exemple, la première partie descendante du RMS juste après le site d'injection, ou la elbow région des RMS, ou juste après le coude avant neuroblastes entrer l'OB).
- Mettre en place l'imagerie time-lapse avec les actions suivantes:
- Sur le microscope, cliquez sur le bouton L100 pour permettre à balayage laser de l'échantillon.
- En Volocity, ouvrez le changeur laser ultraView en sélectionnant le laser approprié (par exemple 488 nm laser pour la GFP).
- Régler le temps d'exposition (en général entre 100 à 500 ms) et de l'intensité du laser (en général 20 à 30%) en fonction de l'intensité du signal fluorescent.
- Réglez le gain d'image numérique pour améliorer la visualisation de la cellule.
- Sélectionnez l'intervalle z-pile à l'image à l'intérieur de la tranche de cerveau (généralement sur une intervalle de 100-120 um). Choisir un intervalle d'un nombre approprié de cellules isolées pour éviter des chevauchements possible, autant que possible (ce qui facilitera l'analyse de suivi ultérieur).
- Sélectionner l'espacement entre chaque image z-pile (habituellement 2-4 um).
- Choisissez le moment intErval entre chaque capture z-pile (par exemple 3 min) et la durée totale de formation d'image (par exemple de 3 heures).
- Cliquez sur l'icône "Sauvegarder" pour enregistrer les modifications apportées aux paramètres d'imagerie.
- Appuyez sur le bouton d'enregistrement pour commencer l'imagerie.
- Alternate imagerie d'échantillons témoins et expérimentaux (par exemple véhicule / traitement médicamenteux ou différents plasmides par électroporation) dans l'ensemble le même jour.
4. Analyser neuroblaste migrations
- Dans le module Volocity quantification, ouvrez la bibliothèque souhaitée créé après avoir terminé une expérience time-lapse. Sélectionnez "Mise au point étendue" de la boîte en haut à gauche (figure 4A, étape 1).
- Cliquez sur l'onglet "Mesures" pour afficher la fenêtre de mesure (figure 4A, étape 2).
- Une liste de tâches est visible dans le coin inférieur gauche de l'écran. Drag "Track" (présent sous le titre «Divers» au bas dela liste) sur l'espace ci-dessus. Cela incitera l'ouverture d'une nouvelle fenêtre appelée "Track" à la partie supérieure gauche de l'écran (figure 4A, étape 3).
- Sélectionnez "Points" de l'onglet "Input" dans la fenêtre Track (figure 4A, étape 4).
- Cliquez sur l'outil Point (figure 4A, étape 5).
- Commencer le suivi de la neuroblastes migration en cliquant avec la souris sur la zone centrale du corps cellulaire et de garder le suivi des mouvements de la cellule jusqu'à ce que le dernier point de la time-lapse de temps est atteinte (par exemple le point numéro 61 pour un film de 3 heures de long) .
- Pour obtenir des données choisir "Faire Point de mesure" dans le menu Mesures (figure 4B, les étapes 6-7). Une fenêtre apparaît au centre de l'écran.
- Dans cette fenêtre, sélectionnez "Un nouvel élément de mesure appelée:" et tapez un nom (figure 4C, étape 8). N'oubliez pas de sélectionner l'option "Tous les points de temps" avant presser OK (figure 4C, étape 9). Un fichier d'élément de mesure apparaîtra sous le fichier time-lapse et contenir des paramètres pour l'analyse quantitative (par exemple, la distance de migration, de vitesse, de déplacement, et taux de déplacement).
- Double-cliquez sur le fichier d'élément de mesure de l'ouvrir comme une fenêtre (figure 4D, l'étape 10).
- Pour visualiser les pistes individuelles de cellules analysées, choisissez «Point chenilles" dans les options d'affichage "" (figure 4D, étape 11).
- Faites un clic droit sur le fichier d'objet de mesure et de l'exporter en tant que fichier texte, qui peut ensuite être importé dans des programmes comme Excel pour analyser les paramètres de migration.
- Pour mesurer les mouvements entre les images consécutives et les pauses faites par chaque cellule au cours de la période de tournage, dans le fichier d'objet mesure, sélectionner des options "Affichage" "point" ou "populations" et cliquez sur ID (chaque piste a un numéro d'identification unique). Exportez le fichier résultant par procéderment comme expliqué à l'étape 4.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Étiquetage des neuroblastes migrateurs SVZ dérivés peut être observé le long des RMS, habituellement 4-8 jours après une électroporation réussie (figure 1B). Points de plus longues peuvent également être choisis, mais moins de cellules se trouvent dans les RMS, car la plupart d'entre eux sont entrés dans l'OB. Neuroblastes commencent acquisition morphologie typique et les caractéristiques de cellules granulaires matures dans l'OB environ 2-3 semaines après l'électroporation (non représenté). Après culture pendant ~ 1 heure, des tranches de cerveau de souriceaux électroporation peuvent être visualisés de manière fiable jusqu'à 3-4 heures. Comme indiqué précédemment 23,26, neuroblastes peuvent afficher les dynamiques migratoires complexes (Figure 3 et vidéo 1), qui peut être analysé quantitativement en utilisant le suivi de la cellule (figure 4).
Figure 1. Postna tal électroporation in vivo. (A) Schéma d'électroporation in vivo d'un jour 2 chiot postnatal de la souris. Une ligne en pointillés (rouge) reliant l'oeil au point de repère lambda craniométriques sert de marqueur de position pour l'insertion capillaire. Le point d'injection est indiqué par un point vert. Des formes ovales gris indiquent la position de l'électrode comme décrit dans Boutin et al. 15 (B) sagittale du cerveau antérieur de souris immunocolorée tranche pour la GFP 5 jours après l'électroporation d'un plasmide exprimant la GFP. Neuroblastes migrent SVZ dérivés sont visibles le long des RMS et certains d'entre eux ont commencé à atteindre l'OB. Ctx: cortex; SVZ: zone sous-ventriculaire; RMS: flux migratoire rostral; OB: bulbe olfactif. Bar, 400 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figure 2. Étapes schématiques dans la préparation des cultures de tranches de cerveau de courte durée pour l'imagerie. (A) Caudal et réductions intrahemispheric (lignes pointillées) sont effectuées sur un cerveau fraîchement disséqué. (B) L'hémisphère cérébral électroporation est placé sur un support vibratome. (C) tranches sagittales sont obtenus avec un vibratome et observées au microscope fluorescent standard . (D) tranches avec le meilleur signal de la GFP sont cultivées pendant au moins 1 heure sur une Millicell insérer dans un plat à fond de verre, et (E) ensuite placé dans une chambre de l'environnement pour l'imagerie par un confocal inversé filature système de disque. Cliquez ici pour agrandir l'image .
les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figure 3. Imagerie time-lapse de neuroblastes en migration. (A) Spinning images de disque de time-lapse de neuroblastes prises à partir d'un cerveau sagittal tranche de la souris 5 jours après l'électroporation d'un plasmide exprimant la GFP. Les images sont 1 heure d'intervalle. Chaque panneau est une projection z-stack de 28 images consécutives 4 pm à part. Pointes de flèches indiquent 4 neuroblastes représentatives migrateurs le long des RMS vers le bulbe olfactif (situé hors de l'image dans le coin en bas à droite). (B) voies migratoires représentatifs obtenus à partir de l'imagerie time-lapse de 4 neuroblastes mis en évidence dans (A). (C) Le graphique montre la distance migré avec le temps par 2 neuroblastes représentatives. Cellules affichent un comportement mobiles saltatory typique. Bar, 70 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Analyse de suivi de la migration des neuroblastes. Des étapes séquentielles utilisées pour suivre la migration des neuroblastes en utilisant un logiciel Volocity. S'il vous plaît voir le texte pour la description détaillée. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Vidéo 1:. Imagerie Time-lapse de neuroblastes migrent Le film montre une partie de la RMS de la souris avec les neuroblastes migrent GFP marqué obtenus 5 jours après l'électroporation d'un plasmide exprimant la GFP. L'OB est situé hors de la vue vers le coin inférieur droit. Z piles confocales ont été capturées sur un confocale à disque en rotation avec un objectif 20X toutes les 3 mn pendant 3 heures dans un intervalle de 120 um. La vitesse de lecture: 10 images / sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migration efficace de cellules progénitrices neurales le long des RMS assure leur maturation ultérieure en neurones fonctionnels 10. Flux importants de progéniteurs neuronaux dirigés vers l'OB sont visibles dans l'enfance humaine et sont susceptibles de jouer un rôle important au début postnatal le développement du cerveau humain 27. De plus, ces cellules sont capables de cibler des sites du cerveau affectées par une lésion et la neurodégénérescence 4,28. Être capable de suivre en temps réel l'effet de la manipulation génétique sur la dynamique des neuroblastes devient essentiel de bien comprendre comment le mouvement des neuroblastes est guidé et régulé.
Ici, nous avons décrit un protocole pour contrôler la migration des neuroblastes SVZ dérivés par couplage électroporation postnatale in vivo avec time-lapse microscopie confocale à disque rotatif de cultures de tranches de cerveau de courte durée. Plus précisément, nous avons montré comment la migration progéniteurs neuronaux peut être marqué par électroporation dans la SVZ un enc plasmideOding GFP. Selon le but de l'étude, plusieurs types de plasmides peuvent être utilisés (par exemple, en permettant l'expression d'autres protéines fluorescentes ou co-expression de type sauvage / des protéines mutantes d'intérêt, la CRE recombinase, ou shRNA avec des protéines fluorescentes). Nous vous recommandons fortement d'utiliser des plasmides contenant le poulet bêta actine CAG promoteur 29 pour l'expression in vivo. L'imagerie de coupes de cerveau provenant d'animaux électroporation peut également être utilisé pour surveiller la migration radiale des progéniteurs neuronaux dans le OB à des points de temps plus longues (7-10 jours après l'électroporation) 30.
Après une période initiale de la pratique, in vivo postnatale électroporation est une méthode très fiable, ce qui permet l'étiquetage des neuroblastes robuste à la fois pour l'imagerie time-lapse et l'analyse d'immunofluorescence. De plus, cette technique offre un avantage fondamental sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sous les promoteurs spécifiques de neuroblastes,où la majorité des neuroblastes sont étiquetés. En effet, l'électroporation permet étiquetage clairsemée de neuroblastes, permettant ainsi une analyse détaillée de leur morphologie et de migration dynamique. Par rapport à la prestation stéréotaxique de vecteurs viraux 31, cette technique est moins cher, plus rapide et est très bien toléré par les souriceaux. Le principal inconvénient réside dans le fait qu'elle est limitée à des stades précoces après la naissance. En effet, nous vous recommandons vivement d'utiliser jour après la naissance 2 souriceaux, puisque nous avons observé une diminution substantielle de l'efficacité de l'étiquetage à des moments plus tard, lorsque les méthodes de livraison virales deviennent plus approprié 31. Toutefois, les stratégies telles que l'électroporation de plasmides exprimant la CRE dans les modèles génétiques de souris appropriés peuvent être utilisés pour étudier la neurogenèse dans les stades adultes 22.
À deux photons, confocale standard, filature confocale à disque, et à grand champ microscopie de fluorescence peuvent tous être utilisés pour visualiser la migration des neuroblastes 17,23,24. Spinning disque conmicroscopie focale est une alternative moins chère à la microscopie à deux photons. Il permet l'imagerie 3D à une vitesse supérieure à travers de multiples plans z, limitant photoblanchiment par rapport à la microscopie confocale standard et offrant une résolution plus haute que large champ imagerie de fluorescence de 31 à 33. La majorité des neuroblastes en migration ont un soma clairement visible et un processus de leader très dynamique incliné avec un cône de croissance.
Comme cela est décrit par d'autres 17, comportant une chambre de perfusion permettrait d'évaluer directement les effets de commande et de traitements médicamenteux sur la même tranche de cerveau. Bien que nous considérions ce un avantage important, le protocole décrit ici montre qu'il n'est pas absolument nécessaire pour la viabilité cellulaire à perfuser tranches avec oxygénée liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) ou DMEM riche en glucose 17,33. De plus, en utilisant un microscope inversé permet une manipulation plus facile par rapport à l'objectif microscopes droits équipées avec les objectifs d'immersion de l'eau.Nous avons constaté que l'aide d'un objectif 20X longue distance est un compromis optimal, permettant le suivi d'un bon nombre de cellules (généralement 25-40 par tranche) et de produire des images de bonne résolution (vidéo 1). Le suivi automatique est également possible, mais il n'est pas toujours fiable. Pour cette raison, nous recommandons visuel et, si nécessaire, la vérification manuelle des données de pistage automatique. Imagerie grossissement supérieur de neuroblastes simples peut être effectuée en utilisant un objectif Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W. Le plugin ImageJ disponible gratuitement MTrackJ peut également être utilisé pour mesurer le suivi statistique de base 33, mais certains fichiers bruts d'acquisition de données peut être incompatible avec ce logiciel et peut avoir besoin d'être convertis en formats appropriés pour l'analyse, ce qui dans certains cas peut prendre beaucoup de temps . La combinaison de modules d'acquisition et d'analyse d'images fournies par le logiciel de Volocity permet une transition immédiate de capture d'image / traitement pour l'analyse quantitative du paramètre migratoiretres (vitesse, déplacement, etc), qui peuvent être facilement visualisées dans une variété de graphiques (par exemple, montrant les schémas migratoires / distance / directivité / vitesse / persistance / temps passé immobile, etc.)
Neuroblastes affichent un mouvement saltatory, alternant migratoire de phases stationnaires 34,35 (figure 3C). Compte tenu du fait que les phases stationnaires peuvent être entre 4-10 min 32, nous croyons que la capture d'images toutes les 3 min représente un bon compromis pour suivre la migration des neuroblastes avec éclairage minimum et le photovieillissement. Nous voyons rarement cellules arrêt de plus de 6 min, et constatons que, sur une période de 3 heures, ils passent généralement une moyenne de 30 minutes immobile. Selon les rapports précédents, les neuroblastes ont une vitesse moyenne de 60-100 um / h et un indice de méandres moyenne (de déplacement réel sur la distance migré), légèrement au-dessus de 0,6 23,36, ce qui est en accord avec nos observations. Typicallié, environ 60% des cellules montrent un comportement «migratoire» (par exemple suite à des chemins de migration presque linéaires, avec un indice méandres entre 0,6-1) et 20-25% sont «exploratoire» (avec un indice méandres entre 0-0,4), tandis que le reste ~ 20% peut être classé comme "intermédiaire" (alternant des phases migratoires et exploratoires, avec un indice méandres entre 0,4-0,6).
Nous reconnaissons qu'il ya encore des limites à cette technique, car nous ne pouvons pas filmer neuroblastes pour plus de 3-4 heures sans observer des modifications substantielles dans leur motilité. Filmer durée pourrait être augmentée en abaissant la fréquence d'image (mais cela aura une incidence sur l'exactitude de l'analyse de la migration) ainsi que par l'adoption d'une chambre de perfusion afin d'optimiser les conditions environnementales pour l'imagerie. Cependant, le protocole décrit ici, y compris une période de 3 à 4 h de formation d'image représente un compromis convenable permettant la collecte de données suffisantes pour une analyse quantitative d'migration. En effet, jusqu'à présent, nous avons réussi à détecter les effets produits sur la migration par surexpression de la protéine / régulation négative 37 ou par la manipulation pharmacologique après comparaison avec des contrôles appropriés (Sonego et Zhou, résultats non publiés).
En conclusion, la combinaison in vivo postnatale électroporation avec l'imagerie à disque en rotation des cultures de tranches de cerveau représente un outil puissant pour suivre la dynamique de la migration des neuroblastes dans un système ressemblant étroitement à l'environnement in vivo, offrant la possibilité d'étudier en profondeur les mécanismes moléculaires contrôlant neuroblaste motilité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
MS et YZ sont pris en charge par KCL KCL et la Chine bourses de doctorat. MO a été financée par une bourse d'études de doctorat en biotechnologie et Conseil de recherches en sciences biologiques. Nous remercions Masaru Okabe et Jun-ichi Miyazaki pour le plasmide pCX-EGFP et Alain Chedotal et Athena Ypsilanti pour de précieux conseils sur l'électroporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A.
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
