Исследование клеточной миграции в микроизготовленном каналов

Summary

Количественный метод исследования спонтанной миграцию клеток в одномерном замкнутом микросреды описано. Этот метод использует микроизготовленном каналов и может быть использован для изучения миграции большого числа клеток при различных условиях в отдельных экспериментах.

Abstract

Описанный здесь метод позволяет изучать миграцию клеток в ограниченном объеме в одном измерении. Он основан на использовании микроизготовленном каналов, которые налагают поляризованный фенотип в клетках физическими ограничениями. После того, как внутри каналов, клетки имеют только две возможности: двигаться вперед или назад. Эта упрощенная миграция, в которой направленность ограничена облегчает автоматическое отслеживание клеток и извлечение количественных параметров для описания движения клеток. Эти параметры включают скорость клеток, изменения в направлении и паузы во время движения. Микроканалы также совместимы с использованием флуоресцентных маркеров, поэтому подходят для изучения локализации внутриклеточных органелл и сооружений во время миграции клеток в высоком разрешении. И, наконец, поверхность каналов могут быть функциональными с различными субстратами, что позволяет контролировать адгезионных свойств каналов или изучении haptotaxis. Таким образом, система чпрежде чем описано предназначен для анализа миграции больших количествах клеток в условиях, в которых как геометрия и биохимический характер среды находящимися под контролем, способствуя нормализации и воспроизводимость независимых экспериментов.

Introduction

Миграция представляет собой комплекс клеточные функции, что имеет важное значение для многих физиологических процессов в многоклеточных организмов, в том числе развития, иммунного ответа и регенерации тканей. Кроме того, некоторые патологические состояния, такие как опухолевой инвазии и метастазирования полагаться на клеточной подвижности ^1. По этим причинам, миграции клеток стала одним из основных области исследования в контексте фундаментальных и трансляционных исследований. В естественных условиях, большинство тканей характеризуются богатой внеклеточного матрикса и высокой плотности клеток. Миграция клеток таким образом, в физиологических условиях, происходит в сложном ограниченном окружении. Классически, скорее всего, в силу исторических причин и технических ограничений, миграции клеток изучалось в плоских 2D системах, которые не воспроизводят многие свойства окружающей среды, найденных в тканях, таких как заключения. Кроме того, факторы, как клеточной адгезии, которые необходимы для подвижности в 2D, были недавно показал, чтобы не быть necessaRily требуется для миграции в естественных условиях или внутри гелей, предполагая, что механизмы, которые управляют клеток передвижения в 2D и в других средах различны ^2. Несколько системы были разработаны, чтобы имитировать сложные свойства тканей, самых известных гелей существо коллагена, которые направлены на обобщал свойства внеклеточного матрикса состава ^3. Здесь мы предлагаем микроканалов в качестве простого дополнительного метода, который позволяет миграцию исследование клеток в одном измерении под замкнутом среде.

В этой системе клетки мигрируют вместе микроканалов, в которую они поступают спонтанно. Миграционные клетки затем приобретают форму каналов, приняв трубчатую геометрию, которая, скорее всего, усиливает их полярность. Линейное перемещение клеток в каналах позволяет отслеживать автоматический клеток и извлечение количественных параметров из экспериментов. С технической точки зрения, эта система легко и гибко. Coatinг стенках канала можно манипулировать, размер и форма каналов могут быть адаптированы, и большое количество клеток могут быть проанализированы в отдельных экспериментах. Эта система может быть также уменьшено, чтобы выполнить средний анализ экраном диапазон молекул, участвующих в клеточной подвижности. Протокол, описанный здесь был стандартизирован с использованием дендритных клеток (DC) в качестве клеточной модели. Эти клетки играют ключевую роль в иммунной системе, как они участвуют в инициации и поддержании специфического иммунного ответа ^4. Экстракорпоральное, ДК было показано, спонтанно перейти в закрытых средах и поэтому является хорошей моделью для изучения подвижность клеток в микроканалов ^5,6 . Важно отметить, что эта система может быть расширена для анализа миграции любой другой тип клеток подвижных как Т-лимфоциты, нейтрофилы, или опухолевых клеток ^7-9.

Protocol

Важное примечание: Этот протокол предполагает, что формы, содержащий форму для требуемых микроканалов уже сделан. Дополнительная информация о подготовке пресс-формы уже опубликованы ^10. Этот протокол также предполагает, что ДК костного мозга культура известна.

1. Чип Изготовление

1. Смешайте PDMS масло и отвердитель при массовом соотношении 10:01 в пластмассовой чашке. Смешайте оба соединения тщательно.
2. В ролях микс над опорными микроканалов плесени. Общая высота должна быть от 0,5-1 см.
3. Удалить пузырьки воздуха в вакуумном банку колокол в течение 1 часа.
4. Харден PDMS в формы, поместив последний в духовке в течение 2 часов при 65 ° С
5. После того, как PDMS является при комнатной температуре, вырезать большой кусок вокруг структуры с хирургическим скальпелем и очистить его от плесени (рис. 1А).
6. Сверлить отверстия, где клетки будет выведена (как правило, 2 мм) и размер PDMSс хирургическим скальпелем по размеру к стеклянным дном блюда, в которых миграция будет начисленных (рис. 1b). Прежде чем продолжить, удалить остатки пыли с блюдо, используя объектив бумагой для очистки. Это способствует связывание PDMS к стеклу, описанной в шаге 1.10.
7. Очистите малоформатной чип PDMS, содержащий каналы, придерживаясь и пилинг клейкую ленту на структуру сторон.
8. Разрушать ультразвуком куски PDMS 30 сек в 70% этаноле, чтобы удалить пыль и небольшие PDMS частицы. Высушите их быстро после этого путем продувки свежим воздухом.
9. Активируйте PDMS (Сооружения вверх) и чашки для культивирования по воздуха (или кислорода) плазменная обработка в течение 30 сек при 300 мторр.
10. Поместите оба активированных поверхностей в контакте постоянно наклеить PDMS с подложкой. При необходимости использовать металлические щипцы слегка нажать на верхней части PDMS, чтобы заставить контакт между полимером и стекло тарелки (рис. 1в).
11. Инкубируйте чип в печи при 65 ° С FOг 1 час укреплять связывания.

2. Покрытие микроканалов

1. Активируйте всю структуру воздушной плазмы на 300 мторр в течение 1 мин. Это будет способствовать вступление жидкости в каналах на следующем шаге.
2. Быстро Заполнить отверстия входа чипа с фибронектина в концентрации 10 мкг / мл в воде. Другие субстраты, такие как ПЭГ может быть использована для изменения клеток присоединения к стенкам канала. Обратите внимание, что жидкость распространяется по всей структуре. Это можно легко проверить на глаз под регулярным света или с помощью обычного светлое поле микроскопа.
   Примечание: В очень небольших структур, в которых диффузия труднее, вход жидкости в каналах может быть принудительно путем размещения структуры в вакуумном колоколе банку в течение по крайней мере 15 мин. Для проверки эффективности покрытия флуоресцентные субстраты могут быть использованы (рис. 2).
3. Инкубируют 1 час при комнатной температуре, чтобы позволить адсорбцию фибронектина или любой другой SUBST покрытияСкорость к стенкам каналов.
4. Вымойте структуры 3x с PBS, чтобы удалить nonbound подложку.
5. После промывки перейти к протоколу 3 или хранить чип при 4 ° С для последующего использования (24 ч максимум).

3. Сотовый Загрузка

1. Снимите PBS от пластины и заполнить микросистему с клеточной среде. Пусть инкубировать в течение 1 часа, чтобы насытить каналы с среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с наркотиками, как молекулы ингибиторов, рекомендуется, чтобы preincubate каналы в среде, содержащей препарат в правильной концентрации. Кроме того, некоторые лекарственные препараты, как правило, для растворения в структуре PDMS что снижает эффективную концентрацию. Некоторые решения были предложены, чтобы противодействовать этой проблемы ^11-12.
2. Удалить плавающие РС и восстановить полу-прилипшие клетки путем промывки культуральной среде. Граф клеток с помощью гемоцитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ядра изображений, 33342 окрашивание Хехст может быть достигнуто заранее вcubating 2 х 10 ⁶ клеток в течение 30 мин с красителем на 200 нг / мл в полной среде. Промыть дважды центрифугированием для удаления избытка красителя, прежде чем продолжить протокол.
3. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин (скорость и время может быть различным в зависимости от типа клеток) и отбросить среды. Развести осадок, чтобы достичь концентрации 20 × 10 ⁶ клеток / мл.
4. Удалить избыток среды от пластины и очистите отверстия входа в структуре PDMS с помощью микропипетки. Заполните записи с 5 мкл раствора клеток достичь количества 1 х 10 ⁵ клеток в каждом отверстии входа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая плотность клеток требуется, чтобы способствовать контакт клеток с каналов. Низкая плотность клеток может привести к низким числом клеток внутри каналов и отказа эксперимента.
5. Инкубируйте микрочип в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе. Добавить 2 мл полной среды в эксперименте блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся структура PDMS должна бе покрыта во избежание сушку клеток в ходе эксперимента. Если 2 мл не хватает, добавить больше среднего, чтобы полностью покрыть структуру PDMS.

4. Изображений

1. Протирайте внешние поверхности дна посуды с очистки объектива ткани до размещения пластин под микроскопом.
2. Для анализа миграции в большого числа клеток, использовать 10-кратным увеличением и широким освещения поля в СО ₂ и температуры оборудованной видео-микроскопа (рис. 3). Для облегчения отслеживания клеток, Хехст окрашивание и ультрафиолетовый свет может быть использован (см. шаг 3.2). Миграция может быть также проанализированы с помощью конфокальной микроскопии того, чтобы получить более высокое разрешение клеточных структур во время миграции.
3. Для покадровой микроскопии в 10 раз, выбрать частоту времени в соответствии с ожидаемой скоростью клеток (обычно 2 мин для дендритных клеток, мигрирующих со скоростью 5 мкм / мин).
   Примечание: Протокол, описанный здесь делает пOT включать анализ параметров миграции клеток. Несколько пунктов перечислены в обсуждении, чтобы консультировать читателей о том, как приступить к извлекать информацию из покадровой фильмов.

Representative Results

В каждом эксперименте поверхность PDMS покрыта молекулы, адаптированной к интересам исследования. Рисунок 2 показывает каналы, покрытые флуоресцентной молекулой, PLL-г-PEG, до и после мытья (шаг 2.4). Такой эксперимент позволяет контролировать однородности покрытия в каналах.

После нагрузки сотовой ячейки, видео микроскопия может быть выполнена следовать миграцию клеток. Фиг.3А показывает пример DC миграции в микроканалов с плотностью, соответствующей отслеживать клетки. Оба, фазовый контраст и окрашивание Hoechst могут быть использованы для этой цели (см. обсуждение). Методика также совместим с флуоресцентной конфокальной микроскопии в высоком разрешении, и может быть использована для отслеживания органеллы или клеточные структуры. 4В показан пример динамики полимеризованном актина в миграции ДК выражающие LifeActGFP.

Пример количественного клеткиподвижность проанализированы в мигрирующих ДК показано на рисунке 5. 5А показывает kymographs полученные от WT или Y27632 обработанных DC. Y27632 хорошо характеризуется ингибитором клеточной сократимость и миграции, а также был использован для проверки способности системы обнаруживать изменения в скорости. В kymographs могут быть дополнительно проанализированы, чтобы извлечь положение и размер клеток как функции от времени, что позволяет изучение различных параметров для описания миграции клеток. Фиг.5В показывает скорость миграции, отслеживаемый изображений ядра позиционирования с использованием собственное программное обеспечение ^13. ДК имеют среднюю скорость, близкую к 6 мкм / мин. Лечение Y27632 значительно снижает их скорость. Этот пример показывает силу технике, которая позволяет количественно оценить большого количества клеток в отдельных экспериментов и полезность системы выявлять различия, вызванные лекарственной терапии. Это может быть расширен с использованием миРНК и скрининга молекул молекул участвуют в контроле миграции.

Рисунок 1. Этапы каналов сборки. Чип PDMS была воспроизведена из формы канала. (A) чип, содержащий каналы экстрагировали непосредственно из формы. (В) Чип изменяется в соответствии с экспериментальной блюдо и отверстие было сделано, чтобы позволить вступление клеток. (С) Чип наконец вставили в верхней части стеклянной посуде. (D и E) Схематическое представление устройства. (D) Вид сверху. (Е) Вид сбоку. Зеленые объекты представляют собой клетки в или из каналов (синий). Бар 1 см.

es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Покрытие каналов с флуоресцентным субстратом. (A) 5 мкм х 5 мкм каналы, инкубированные с флуоресцентным ПЭГ в концентрации 100 мкг / мл в течение 1 часа. (B) изображение Данная из оставшихся флуоресцентного ПЭГ после промывки PBS каналов. Бар 50 мкм.

Рисунок 3. Клетки мигрируют вдоль микроканалов. Фаза контраст (серый) и ядро окрашивание (синий) из клеток, мигрирующих в 5 мкм х 5 мкм микроизготовленном каналов. () Одиночное изображение извлекается из фильма ДК мигрирующих вдоль каналов. (В) Монтаж показывая смещение селективнымТед DC миграции вдоль каналов. Белые стрелки указывают мигрирующих клеток. Шкала времени 1 Попадания / 2 мин. Бар 50 мкм.

Рисунок 4. Пример клеток с высоким разрешением в микроканалов. Изображений с высоким разрешением ДК миграции вдоль отдельных микроканалов. (А) Монтаж контрастных изображений фазовых (1 img/20 сек) из DC миграции в микроканале (увеличение в 100 раз). (В) Монтаж в выражающего lifeact постоянного тока (основные моменты полимеризации актина), свидетельствующая о соответствии системы с флуоресцентной томографии (1 img/20 сек, 60X увеличением, одного оптического разделе). Полимеризованный актина черным цветом. Размер 10-й канал высокой мкм в ширину х 5 мкм. Бар 10 мкм.

Рисунок 5. Представитель результаты ДК миграции вдоль микроканалов. Эта цифра показывает тип анализа, что можно сделать из фильмов клеток мигрируют вдоль микроканалов. 5А показывает kymographs полученные от контрастных изображений в заданный промежуток времени фазовых WT или Y27632 обработанных ДК мигрирующих в микроканалов (10X, 1 ов / 2 мин). фиг.5В показан пример количественной оценки скорости клеток, полученной после отслеживания ядро постоянного тока с помощью Hoechst окрашивание и собственное программное обеспечение ^13. Данные анализировали с использованием непараметрического критерия Стьюдента (тест Манна-Уитни). Бар 100 мкм.

Discussion

Здесь мы опишем устройство состоит из микроканалов в качестве метода изучения миграционных свойств большого количества клеток в отдельных экспериментах. Эта экспериментальная система имитирует замкнутые экологические ограничения, найденные в тканях эндогенными перелетных клеток. Однако, заставляя миграции в одном измерении, это облегчает автоматическое отслеживание клеток и извлечение measurables (рис. 5). Мы также показываем, что наш прибор совместим с флуоресцентной микроскопии и поэтому может быть адаптирована для изучения органелл позиционирование во время различных фаз клеточной подвижности (рис. 4).

Важным шагом в рамках протокола является качество каналов. Важно контролировать хороший слипания PDMS на поверхности стекла. Когда беды прилипания появляются первые Что нужно проверить чистота обе поверхности и один из пылесоса плазмы. Другой параметр, который может быть критическим является йэ плотность загружалась клеток. Спонтанная миграция требует непосредственной близости от клеток к каналам для облегчения вступления в трубах, и оптимальное количество должно быть оценено для каждого типа клеток.

В качестве примера, мы показали спонтанную миграцию домена, но система может быть использована для анализа миграции клеток других типов. В лаборатории мы протестировали первичных Т-лимфоциты, макрофаги, а также опухолевых клеточных линий (данные не показаны и ссылки ^7-9).

Для анализа миграции клеток в каналах, две основные протоколы были протестированы. Первое требует визуализации на фазового контраста (10X), и основан на автоматического обнаружения и генерации kymographs от мигрирующих клеток ³ (рис. 5, а). Скорость, размер ячейки и настойчивость являются, в частности, параметры, которые можно извлечь из kymographs. Эта система ограничена качества kymographs и к развитиюпрограммное обеспечение для создания и анализировать их. Второй и более простой способ для количественной оценки данных основывается на полу-автоматизирован отслеживания ядра с помощью Hoechst окрашивания (рис. 3). Использование флуоресценции позволяет отслеживать и анализ миграции со стандартным ПО для обработки изображений. Примером такой стратегии была разработана для первой гонки мир клеток ^12.

Учитывая, что поверхность PDMS можно адсорбировать практически с любым белком, микроканалы могут быть использованы для оценки влияния белков внеклеточного матрикса в миграции клеток. Геометрия каналов может быть также изменена, облегчая изучение влияния физических ограничениях в миграции клеток.

Наконец, этот экспериментальный система может быть выполнен с возможностью получать несколько условий в отдельных экспериментах. Это, вместе с полу-автоматизирован анализа, совместим с средней пропускной показы для открытия новых актеров привлечьд в миграции раковых клеток.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254