Summary
Dit protocol is ontworpen om blootstelling werkwijze celculturen aan geïnhaleerd giftige chemicaliën tonen. Blootstelling van gedifferentieerde lucht-vloeistof interface (ALI) culturen van epitheelcellen biedt een uniek model van de luchtwegen blootstelling aan giftige gassen zoals chloor. In dit manuscript beschrijven we effect van chloor blootstelling aan lucht-water grensvlak kweken van epitheelcellen en ondergedompelde kweek van cardiomyocyten. In vitro blootstelling systemen kunnen belangrijke mechanistische studies routes die vervolgens kunnen worden gebruikt om nieuwe therapeutische middelen te ontwikkelen evalueren.
Abstract
Celculturen onmisbaar te ontwikkelen en bestuderen werkzaamheid van therapeutische middelen vóór het gebruik in diermodellen. Wij hebben de unieke mogelijkheid om het model goed gedifferentieerd menselijke luchtwegepitheel en hartspiercellen. Dit kan een waardevol instrument om de schadelijke effecten van toxische geïnhaleerde stoffen, zoals chloor, die normaal kan zijn op het celoppervlak, en vormt diverse bijproducten na reactie met water, en het beperken van hun effecten ondergedompelde culturen bestuderen. Ons model met behulp van goed gedifferentieerd menselijke luchtwegen epitheelcelkweken bij lucht-liqiuid-interface omzeilt deze beperking evenals biedt een gelegenheid om kritische mechanismen van toxiciteit van potentieel giftige ingeademde stoffen te evalueren. We beschrijven verbeterde verlies van membraan integriteit, caspase vrijlating en dood aan giftige chemische ingeademde zoals blootstelling chloor. In dit artikel hebben we methodes voorgesteld om de blootstelling chloor modelleren in zoogdiercellen hart en luchtweg epitheel cellen in cultuur en eenvoudige tests om het effect op deze celtypen te evalueren.
Introduction
Blootstelling aan giftige geïnhaleerde stoffen (TIC) / gassen zoals chloor (Cl 2) blijft een voortdurende gezondheidsprobleem in toevallige blootstelling en hun mogelijk gebruik als een chemisch agens bedreiging. Hoewel de longen zijn de primaire doelwit zijn organen zoals hart en de hersenen ook beïnvloed 1-3. In vivo modellen worden algemeen gebruikt voor de toxiciteit van tics, maar in vitro assays voor toxiciteitsbeoordeling eenvoudiger, sneller en goedkoper. In vitro modellen laten ook uitgebreid onderzoek van middel-cel interacties die moeilijk te evalueren in vivo kunnen zijn. Dergelijke in vitro belichtingssystemen zijn zeldzaam en bovendien in sommige conventionele modellen waarin giftige stoffen worden toegevoegd aan het kweekmedium waarin de cellen ondergedompeld zijn, de eigenschappen van de agenten kunnen veranderen als gevolg van interacties en binding aan componenten in het medium. In dergelijke scenario's celkweek systemen zoals lucht-vloeistof interface (ALI) Culturen van primaire humane epitheelcellen, hier voorgesteld, die direct kunnen worden blootgesteld aan gasvormige middelen kunnen zijn veelbelovend.
Epitheelcellen van de luchtwegen zijn de eerste regels van de verdediging tegen ingeademde giftige chemicaliën. De menselijke luchtwegepitheel vormt een fysieke barrière tussen het lumen en de onderliggende cellen in de long en deelneemt aan de reactie van de long. Het produceert een aantal cytokines en andere pro-en anti-inflammatoire middelen en scheidt slijm / luchtwegen oppervlak vloeibaar (ASL) die het epitheel. Een van de beperkingen in conventionele ondergedompeld in vitro kweeksystemen is ook dat de ASL en slijm dat de epitheliale oppervlak bedekken wordt verwijderd of verdund. Dit strookt niet met de fysiologische toestand van longepitheelcellen die zijn blootgesteld aan de lucht. Daarom zou een ideaal in vitro systeem voor TIC toxiciteit deze architectuur repliceren. Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling snelle screening methoden dat in vivo toxiciteit voorspellen. Epitheliale cellen gekweekt bij de ALI differentiëren en hebben goed gedifferentieerde structuren en functies in vergelijking met cellen gekweekt onder water en een superieur model van de luchtwegen dienen.
In deze studie beschrijven we het gebruik van lucht-vloeistof-interface van de cultuur van de menselijke luchtwegen (tracheobronchiale) epitheelcellen voor het testen van giftige inhalatie toxiciteit gas en vergelijk het met een verzonken celkweek van cardiomyocyte, vandaar studie van een ander belangrijk doelwit voor de toxiciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rat Cardiomyocyte Cultures
- Alle experimenten werden uitgevoerd onder protocollen door de institutionele Animal Care en gebruik Comite, IACUC goedgekeurd.
- Verkrijgen hartspiercellen rat uit het hart (ventrikels) van mannelijke ratten (240-260 g) met behulp van methoden die eerder 4 beschreven. Kort verdoven dieren met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (100 mg / kg; bevestigen verdoofd door teen knijpen methode) en vervolgens verwijderen harten in 10,0 ml, 1 mM Ca2 + bevattende Krebs Ringer buffer, pH 7,4.
- Spoel de harten 5-6x om bloed te verwijderen en dan overschakelen naar een Ca 2 + gratis Krebs Ringer buffer met 0,02% protease en 0,06% collagenase A (5,0 ml / hart). Incubeer de harten in deze oplossing gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C met af en toe schudden.
- Na 10-15 minuten, spoel dan de enzymatische oplossing met Ca 2 + gratis Krebs Ringer buffer voor nog eens 5 minuten. Laat de cellen van de slappe weefsel onsing van een pipet 25 ml pipetteren de schorsing op en neer meerdere malen.
- Scheid de cellen van weefsel door filtreren door een 70 um nylon mesh en hen in staat stellen om zich te vestigen in Krebs Ringer buffer die 0,1 mM Ca 2 +. Hang de cel pellet in 1,0 ml Krebs Ringer buffer met 0,2 mM Ca 2 +.
- Layer voorzichtig over 5,0 ml 60 ug / ml runder serumalbumine, BSA, in 15 ml centrifuge buizen, om hartspiercellen te scheiden van nonmyocytes en hen in staat stellen om zich te vestigen gedurende 30 minuten. De hartspiercellen zijn zwaarder en naar de onderkant van de buis. Verwijder voorzichtig het supernatant cellen en media. Herhaal deze stap eenmaal het verder zuiveren van de cellen.
- Geleidelijk overgang door wassen (in stappen met 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM en 1,0 mM Ca2 + bevattende buffer) de ventriculaire myocyten / hartspiercellen op 1,0 mM Ca2 + bevattende buffer en geresuspendeerd in ACCT medium bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-carnitine, 5 mM creatine, 5 mM taurine, 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
- Plate de cardiomyocyten als ACCT medium bij een dichtheid van 100 tot 150 cellen / mm 2 op 100 mm of 35 mm laminine beklede plastic kweekplaten of 40 x 22 mm glazen dekglaasjes tevoren met laminine (1 ug / cm 2). Na 1 uur werd de vaat met 2,0 ml ACCT cellen die niet zijn aangesloten verwijderen. Voeg 10,0 ml vers medium en incubeer de cellen.
2. Gedifferentieerde Air-vloeistof interface (ALI) cultuur van de mens luchtwegepitheelcellen basale cellen
- Procure menselijke tracheobronchiale weefsels van National Disease Research Interchange onder Institutional Review Board goedgekeurde protocollen. Celoogst en het uitvoeren van cultuur met behulp van een gepubliceerde procedure 5,6. Deze procedure maakt gebruik celculturen omdat ze een nauwkeurig model voor humane inhalatie blootstelling tics echter, indien nodig kan isoleren en groeien ALI mogebruik en / of ratten epitheelcellen 7,8.
- In het kort, maak kleine stukjes (~ ¼ inch) van het weefsel na het verwijderen van alle bindweefsel en de lymfeklieren. Was weefsel meerdere malen in Ringerlactaat. Weefsels In een 50 ml conische buis en voeg protease-oplossing (1% Protease/0.01% DNase in minimaal essentieel medium, MEM, weefsel vloeistof verhouding (01:10)).
- Rock the weefsel bij 4 ° C voor de overnachting. Beëindig de dissociatie van het weefsel door toevoeging van 10% foetaal runderserum. Schraap het epitheliale oppervlak met een chirurgisch scalpel en verzamel de cellen door centrifugeren (2000 rpm gedurende 10 min).
- Plaat cellen bij passage een op collageen gecoate snapwells in bijzondere ALI medium bereid zoals beschreven door Fulcher et al. 9. Cultuur voor 5 dagen voordat u aan de lucht-vloeistof interface (ALI) door het verwijderen van apicale media.
- Voer de cellen met ALI media om de andere dag en laat de cellen differentiëren extra 2-3 weken (observeren tal kloppend cilia en slijm afscheiding) voor het uitvoeren van blootstelling. Was de apicale oppervlak met warm PBS samen met media veranderingen.
3. Chloor Exposure
- Bevatten de belichting chloor systeem (CES) in een gekwalificeerde chemische kap met een operationele gezicht snelheid van 100 fpm dat de noodzakelijke secundaire maatregelen om blootstelling van het personeel in geval van accidentele chloor lekkage te voorkomen biedt.
- Gebruik het systeem onder lichte overdruk (0,5 inch water). Droge lucht wordt toegevoerd bij 15 L / min en een passend chloor wordt toegevoerd aan de gewenste uiteindelijke chloorconcentratie bereiken. De kamers hebben een deksel met vergrendeling met 4 mini BCU sloten en een lage hardheid siliconen pakking om de druk afdichting.
- Lever de Cl 2 mengsel door een Mass Flow Controller. De CES maakt gebruik van een cilinder met samengeperst gas dat 1,0% Cl 2 in droge stikstof.
- Regel de verdunning luchtstroom met behulp van deop maat ontworpen bedieningspaneel en evenzo regelen de Cl 2-concentratie geleverd aan de expositiekamers. Een laag volume bemonsteringspomp trekt de uitlaatgassen van de kamers in een chloor analyzer aan concentraties die vervolgens worden opgenomen op een datalogger aangesloten op de analysator te controleren.
- Meet de debieten in de kamers voorafgaand aan blootstelling met behulp van een flowmeter op gelijke levering en afzuigdebieten verzekeren.
- Bereid de celculturen voor de belichting door het verwijderen van het supernatant media en het toevoegen van verse media (basolaterale media in ALI culturen). Eventuele voorbehandelingen met middelen kan worden uitgevoerd op dit moment.
- Expose de ALI culturen van epitheelcellen tot Cl 2-gas (50, 100 of 300 ppm gedurende 30 minuten) in de twee verzegelde polysulfon biocontainment kamers. De cardiomyocyten (water of confluente kweken op membranen) worden blootgesteld aan 50 of 100 ppm Cl 2 gedurende 15 minuten.
- Na blootstelling spoelen de kamers met lucht totdat de Cl 2-niveau onder 1 ppm en veilig kan worden geopend om cellen te verwijderen (binnen 5 min).
4. Transepitheliaal Elektrische weerstand (TER) Meting
- Meet de TER van lucht-vloeistof-interface, ALI, culturen met behulp van een epitheliale voltohmmeter met een paar zilveren chloride "eetstokje" elektroden.
- Equilibreer het eetstokje elektrode in de ALI media 15 min. voor gebruik.
- Voeg warm media om het apicale (1,0 ml) en basolaterale (2,0 ml) oppervlak en meet de TER met de chopstick elektroden van de voltohmmeter.
- Dompel de kortere arm van de elektrode in apicale media en de langste arm in de basolaterale media. Klik op de 'maatregel' knop op de voltohmmeter om de elektrische weerstand te evalueren.
- De voltohmmeter heeft de optie om ohm of k ohm meten. Trek de weerstand over een celvrije kweek steun van de weerstand gemeten over elke cellaag aan de trans opbrengstepitheliale weerstand (TER).
5. Caspase Meting
- Voeg vers ALI medium (2,0 ml) aan het basolaterale oppervlak na blootstelling en incubeer de cellen bij kamertemperatuur. Verzamel supernatant media op 4 en 24 uur.
- Maatregel caspase 3/7 activiteit in de media supernatanten met een commercieel caspase 3/7 testkit.
6. Western Blot en Immunocytochemie
- Voer western blots met cellysaten zoals eerder beschreven 10. Hang het eiwit lysaat (20 ug) in 5x gereduceerd monster buffer en kook gedurende 5 minuten. Onderwerp het eiwit lysaat aan SDS-PAGE (4-15%) en breng de gescheiden eiwitten naar een nitrocellulosemembraan door elektroforetische blotting.
- Blokkeer niet-specifieke binding door het incuberen van het membraan met 5% melk in wasbuffer (PBS + 0,1% detergens) en sonde de membranen met primaire antilichamen tegen SERCA2 of sarcomeer actine bij 1:1000 verdunning, overnacht bij 4 ° C. Vervolgens wassen en incubeer membranen de respectieve peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en ontwikkelen van detectie zoals eerder beschreven 10 met commerciële peroxidase detectiekit.
- Voor immunocytochemie behandelen levende cellen gekweekt op inzetstukken of dekglaasjes in 6-well platen met 0,4% Triton-X-100 in 10 mM natrium citraat buffer gedurende 20 minuten na het spoelen met PBS.
- Blok specifieke binding door behandeling van de cellen met 5% ezel serum gedurende 20 min en vervolgens incuberen van de cellen met niet-specifiek IgG of specifiek sarcomeer actine of Ki-67 afzonderlijke primaire antilichamen.
- Was de cellen met PBS en geïncubeerd met fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen tegen het primaire antilichaam en een nucleaire kleuring (1 ug / ml DAPI) detecteren.
- Wassen met PBS en monteer coverslips met behulp van commerciële montage media.
- Visualiseer de kleuring met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire staafvormige hartspiercellen bevestigen op laminin matrices en verspreiden en differentiëren tot samenvloeiing culturen (Figuur 1A en haar inzet). Deze cellen werden verder gekarakteriseerd op basis van sarcomeer actine en SERCA2 expressie (Figuren 1B en 1C). Rat cardiomyocyten zijn zeer gevoelig voor toxiciteit chloor 15 minuten blootstelling aan 100 ppm chloor veroorzaakt uitgebreide celronding en dood submerse cultuur en verstoring van confluente lagen op cellen gekweekt op laminine beklede membranen (Figuur 1D). Er werd ook verbeterd apoptotische celdood zoals aangegeven door caspase 3/7 release in hartspiercellen gekweekt op inserts (figuur 1E).
Blootstelling van gedifferentieerde menselijke luchtweg epitheel (figuur 2, inzet te paneel 1 toont een dwarsdoorsnede van celkweek inserts met zuilvormige, trilharen en slijmbekercellen) chloor veroorzaakt vervelling en lifting van celmembranen bij zowel lage (100 ppm) en hoog (300 ppm) concentraties (Figuur 2 paneel A2 en A3). Schade door lage chloorgehalte werd snel omgekeerd (Figuur 2 paneel A5), echter cellen blootgesteld aan hogere chloorgehalte was vertraagd of geen onderhoud toereikend (Figuur 2 panel A6) zoals door visuele inspectie en celproliferatie beoordeling door Ki-67 kleuring (Figuur 2 panel A9). Trans epitheliale elektrische weerstand, TER metingen en caspase activiteit die bevestigde deze resultaten en bewijzen voor het verlies van membraan integriteit en apoptose na blootstelling chloor (Figuur 2, paneel B en C). Dus onze studies beschrijven de ontwikkeling van een in vitro Cl 2 belichtingssysteem dat het verlies van membraan integriteit en dood van luchtwegepitheel en cardiomyocyten veroorzaakt. Dit effect kan niet door niet-fysiologische pH-wijzigingen in de cardiomyocyten alsde pH van het materiaal na blootstelling aan chloor werd op ~ 7,4 zoals gemeten met een pH-meter in de verzamelde media postexposure.
Figuur 1. Rat cardiomyocyten isolatie en blootstelling aan chloor. Rat cardiomyocyten werden geïsoleerd zoals beschreven in het protocol en uitgeplaat op laminine-beklede plastic schaaltjes (paneel A, een representatief lichtbeeld microscopische) of inzetstukken laminine bedekt. Inzet te paneel A toont een staafvormige cardiomyocyte verspreiden en differentiëren. De hartspiercellen werden ook gekenmerkt op basis van de sarcomeer actine expressie (paneel B toont een representatief beeld gedetecteerd door immunofluorescentie en rijstrook een paneel C toont een representatieve western blot scan) en overvloedige SERCA2 expressie (paneel C laan b). Chloor blootstelling (100 ppm 15 min) veroorzaakte uitgebreide celdood inondergedompelde culturen en verstoring van de cel monolaag op de inzetstukken (paneel D toont de representatieve microfoto). Caspase 3/7 afgifte (paneel E) in het supernatant media cardiomyocyten geteeld op inzetstukken op 4 uur en 24 uur na blootstelling aan chloor werd gemeten zoals beschreven in de tekst. De weergegeven waarden zijn gemiddelde ± SEM en * geeft significante (p <0,05) verschil 0 ppm controle.
Figuur 2. Effect van chloor blootstelling op gedifferentieerde menselijke luchtweg epitheel lucht-vloeistof interface (ALI) culturen. Menselijke luchtwegepitheelcellen basale cellen werden gekweekt op collageen gecoate snapwells. Na dag 5 de apicale media werd verwijderd. Gedifferentieerde culturen (bestaande uit basale, trilharen, zuilvormige, en slijmbekercellen zoals getoond op de inzet in top left panel van paneel A) werden blootgesteld aan chloor (100 of 300 ppm) gedurende 30 minuten. De TER werd gemeten en medium werd vervangen en cellen geïncubeerd voor 24 uur. Na 24 uur TER werd opnieuw gemeten en apicale media verzameld voor caspase vrijgavemeting en celmembranen werden voor immunohistochemie. De open pijl in paneel A delen 2 en 3 shows afgeworpen epitheliale laag en zwarte pijlen geven lege plekken op de insert. De pijlpunt in panel A deel 5 toont geregenereerde epitheel. Delen 7, 8 en 9 tonen cellulaire proliferatie beoordeeld door Ki-67 immunokleuring. De weergegeven waarden zijn gemiddelde ± SEM en * geeft significante (p <0,05) verschil 0 ppm controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest voorkomende vorm van acute blootstelling aan gifstoffen ontstaat wanneer men ademt een giftige chemische stof in de longen. Deze chemicaliën kunnen ook snel worden opgenomen in de bloedbaan en invloed kan andere organen zoals hersenen en het hart. Giftigheid bij inademen van diverse agenten met behulp van diermodellen worden bestudeerd en op grote schaal gemeld, maar de mechanismen zijn minder goed begrepen. Dit is een belangrijke hindernis in de ontwikkeling van effectieve therapieën. Afwezigheid van in vitro belichtingssystemen is een hoofdreden voor het gebrek aan mechanistische inzichten. Hier beschrijven we celcultuur modellen van de hartspier en de luchtwegen om de impact van toxische ingeademde stoffen zoals blootstelling chloor bestuderen. Chloor reageert snel met waterige oppervlakken zoutzuur en hypochloorzuur 3,11,12 vormen. Chloor kan ook combineren met reactieve zuurstof species (ROS) tot zeer reactieve verbindingen die kunnen leiden tot oxidatie van essentiële eiwitten en enzymen van de luchtwegen oppervlakken 13 te produceren. Studiesmet ondergedompelde culturen kunnen slechts bewijzen effect van bijproducten zoals HOCl bij chloor dan het gas zelf. Blootstelling van gedifferentieerde ALI, humane epitheelcellen hier beschreven zou kunnen bestuderen directe interacties tics zoals chloor met celoppervlakken Indien de waterige media vergelijkbaar met wat gebeurt in vivo.
Gebruik van primaire cardiomyocyten van de rat, beschrijven we ook dat de blootstelling chloor veroorzaakt een snelle celdood in ondergedompelde culturen. Deze cellen zijn niet in staat te groeien bij ALI omdat zij niet polariseren en vormen tight junctions. Daarom hebben we ook gebruikt confluente kweken van hartspiercellen gekweekt op inserts met een dun laagje media. Blootstelling van deze celmonolagen chloor aangetoond membraan verstoring en verbeterde caspase vrijlating suggereert apoptose een rol kunnen spelen.
Deze studie toont aan dat luchtwegen (de primaire doelgroep van inhalatie die kan worden gerepliceerd door ALI cultures) en organen zoals hart die niet groeien in ALI kunnen worden onderzocht door in vitro belichtingssystemen. Deze in vitro blootstelling modellen kunnen eenvoudig worden aangepast om de effecten van giftige geïnhaleerde stoffen (TIC) beoordelen. Met behulp van deze modellen verwachten we om gedetailleerde mechanistische begrip van de toxiciteit te bieden en nieuwe strategieën om de giftige afspraken verbonden aan TIC / chloor te beperken en vervolgens verder te evalueren in vivo te ontwikkelen. Hoewel, deze posities zijn van korte duur van de blootstelling systeem moet beter repliceren celcultuur condities. Blootstelling aan gassen zoals chloor beperkt het gebruik van vocht omdat het apparaat kan corroderen. De ALI culturen kunnen worden gewiegd te simuleren ademhaling zoals eerder gebruikt in onze blootstelling aan ozon systeem 14,15. Momenteel werken we in deze richtingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door het tegengaan Program, National Institutes of Health (NIH), Bureau van de directeur, en de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW). SA wordt ook ondersteund door Kinderziekenhuis Colorado / Colorado School of Mines Samenwerking Pilot Award # G0100394 en Children's Hospital Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B.
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
