Summary
Этот протокол предназначен для демонстрации метода экспозиции клеточных культур в ингаляционных токсичных химических веществ. Выдержка из дифференцированной воздуха и жидкой фаз (ALI) культур эпителиальных клеток дыхательных путей предоставляет уникальную модель воздействия дыхательных путей токсичных газов, таких как хлор. В этой рукописи мы опишем эффект воздействия хлора на воздух-жидкость культур эпителиальных клеток и глубинной культуре кардиомиоцитов. В пробирке системы воздействия позволяют важные механистические исследования для оценки пути, которые могли бы быть использованы для разработки новых терапевтических агентов.
Abstract
Клеточные культуры необходимы для развития и изучения эффективности терапевтических агентов, до их использования в животных моделях. У нас есть уникальная возможность моделировать хорошо дифференцированных человеческих эпителия дыхательных путей и клетки мышцы сердца. Это может быть бесценным инструментом для изучения вредных эффектов токсичных ингаляционных химических веществ, таких как хлор, которые могут нормально взаимодействовать с поверхности клеток, и образуют различные побочные продукты при взаимодействии с водой, а также ограничение их последствий в затопленных культур. Наша модель, используя хорошо дифференцированных культур человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток на радиоинтерфейса-liqiuid обходит это ограничение, а также предоставляет возможность оценить критические механизмы токсичности потенциальных ядовитых ингаляционных химических веществ. Мы описываем повышенную потерю целостности мембраны, каспазы-релиз и смерть токсичных вдыхаемого химических например воздействия хлора. В этой статье мы предлагаем методы для моделирования воздействия хлора в сердце млекопитающих и дыхательных путей эпителиальных слоктей в культуре и простых тестов, чтобы оценить его влияние на этих типов клеток.
Introduction
Воздействие токсичных химических веществ, вдыхаемых (тики) / газы, такие как хлор (Cl 2) остается постоянной проблемой здравоохранения в случайных воздействий, а также в их потенциальное использование в качестве химического агента угрозы. Хотя легкие являются первичной мишенью, органы, такие как сердце и мозг, также страдают 1-3. IN VIVO модели, как правило, используется для тестирования токсичности от ТЭП, но в пробирке тесты для оценки токсичности проще, быстрее и более экономически эффективным. В модели пробирке также предусмотреть возможность широкого исследования агент-клеточных взаимодействий, которые могут быть трудно оценить в естественных условиях. Такие пробирке системы, связанный с воздействием редки и, более того, в некоторых обычных моделей, где токсичные вещества добавляются к культуральной среде, в которой клетки погруженной, свойства агентов могут изменяться в связи с взаимодействиями и связывание с компонентами в среде. В таких случаях клеточных систем культуры, таких как воздух-жидкость (ALI) культур первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей, предлагаемых здесь, которые могут быть непосредственно подвергающихся газообразных агентов может быть перспективным.
Эпителиальные клетки, выстилающие дыхательные пути являются первыми линии обороны против ингаляционных токсичных химических веществ. Человеческий эпителий дыхательных путей образует физический барьер между просветом и нижележащих клеток в легких и участвует в реакции легких. Она производит ряд цитокинов и других про-и противовоспалительных средств, а также выделяет поверхностную слизь / дыхательных путей жидкостью (ASL), покрывающую эпителий. Одним из ограничений в обычных погружен в культурах клеток также, что ASL и слизи, которые покрывают поверхности эпителиальных удалена или разбавленный. Это не отражает физиологическое состояние легких эпителиальных клеток, которые подвергаются воздействию воздуха. Таким образом, идеал в системе экстракорпорального для испытаний на токсичность TIC должны повторить эту архитектуру. Существует большой интерес к разработке быстрого скрининга мethods которые предсказывают в естественных условиях токсичности. Эпителиальные клетки, выращенные на ALI дифференцировать и имеют хорошо дифференцированные структуры и функции по сравнению с клетками, выращенных затопленных и служить превосходной модель дыхательных путей.
В этом исследовании, мы описываем использование воздушно-жидкостным интерфейса культуры человеческого дыхательных путей (трахеобронхиального) эпителиальных клеток для тестирования ядовитый вдыхаемый газ токсичность и сравнить его с глубинной культуре клеток кардиомиоцитов, следовательно, изучая еще один важный цель токсичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Крыса кардиомиоцитов Культуры
- Все эксперименты проводились под протоколами, утвержденными институциональной уходу и использованию животных комитета, IACUC.
- Получить кардиомиоцитов крыс из сердец (желудочков) самцов крыс (240-260 г), используя методы, описанные ранее 4. Вкратце, обезболить животных с помощью внутрибрюшинного введения пентобарбитала (100 мг / кг; подтвердить анестезию ног метода пинч), а затем удалить сердца в 10,0 мл, 1 мМ Ca 2 +, содержащей Кребс звонка буфер, рН 7,4.
- Промыть сердцах 5-6х для удаления крови, а затем переключиться на Ca 2 + свободного буфера Кребса Рингера, содержащего 0,02% протеазы и 0,06% коллагеназы А (5,0 мл / сердце). Инкубируйте сердца в этом растворе в течение 10-15 мин при 37 ° С с периодическим встряхиванием.
- После 10-15 мин, смыть ферментативную решение с Ca 2 + свободного буфера Кребса Рингера для еще 5 мин. Отпустите клетки от вялого ткани намиING 25 мл пипетки с помощью пипетки подвески вверх и вниз несколько раз.
- Отделите клетки от ткани путем фильтрации через нейлоновую сетку 70 мкм и позволить им поселиться в Кребса Рингера буфере, содержащем 0,1 мМ Ca 2 +. Приостановить осадок клеток в 1,0 мл Кребс Ringer буфере, содержащем 0,2 мМ Ca 2 +.
- Осторожно слой над 5,0 мл 60 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина, BSA, в 15 мл центрифужные пробирки, чтобы отделить кардиомиоцитов из nonmyocytes и дать им возможность поселиться в течение 30 мин. Кардиомиоциты тяжелее и перейти к нижней части трубы. Удалить тщательно супернатант клеток и средств массовой информации. Повторите этот шаг один раз для дальнейшей очистки клеток.
- Постепенно переход промывкой (с шагом использованием 0,25, 0.5 мм, 0,75 мм, и 1,0 мМ Ca 2 +, содержащий буфер) желудочковой миоциты / кардиомиоцитов до 1,0 мм Ca 2 +, содержащий буфер и ресуспендировали в ACCT среде, состоящей из Игла в модификации Дульбекко , DMEM containiнг 2 мг / мл BSA, 2 мМ L-карнитин, 5 мМ креатин, 5 мМ таурина, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Plate кардиомиоцитов в ACCT среде при плотности от 100 до 150 клеток / мм 2 на 100 мм или 35 мм ламинином покрытием пластмассовые чашки для культивирования или 40 х 22 мм покровные стекла, предварительно покрытых ламинином (1 мкг / см 2). Через 1 ч мыть посуду с 2,0 мл АККТ для удаления клеток, которые не прикреплены. Добавить 10,0 мл свежей средой и инкубировать клетки.
2. Дифференцированный воздуха и жидкости интерфейс (ALI) Культура человека эпителия дыхательных путей базальных клеток
- Закупка трахеобронхиального тканей человека от Национального заболеваний Научно-исследовательского обмена под Institutional Review Board одобрил протоколы. Урожай сотовый и выполнять культуру, используя процедуры, опубликованной 5,6. Эта процедура использует клеточные культуры, поскольку они являются точным модель для человеческого ингаляционных воздействиях ТЭП, однако, при необходимости можно изолировать и вырастить на Али М.О.использовать и / или крыса эпителиальных клеток дыхательных путей 7,8.
- Вкратце, сделать небольшие кусочки (~ ¼ дюйма) на ткани после удаления всех соединительной ткани и лимфатические узлы. Вымойте ткань несколько раз в растворе Рингер-лактата. Добавить тканей к 50 мл коническую трубку и добавить протеазы решение (1% Protease/0.01% ДНКазную в минимальной необходимой информации, сувениры, ткани соотношения жидкости (1:10)).
- Rock ткани при 4 ° С в течение ночи. Конец диссоциации ткани добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Царапать поверхность эпителиального с хирургическим скальпелем и сбора клеток путем центрифугирования (2000 оборотов в минуту в течение 10 мин).
- Пластина клеток при прохождении один на покрытые коллагеном snapwells в специальной ALI среде, приготовленной, как описано подробно Фулчер и др. 9. Культура в течение 5 дней до перехода на воздух и жидкой фаз (ALI), удаляя верхушечные СМИ.
- Поток клеток с использованием ALI СМИ каждый дополнительный день и позволяют клеткам дифференцироваться в дополнительных 2-3 недели (наблюдать многочисленные избиения реснички и секрецию слизи) перед выполнением воздействия. Вымойте апикальной поверхности теплой PBS наряду с изменениями СМИ.
3. Хлор экспозиции
- Содержат систему экспозиции хлора (ЕЭП) внутри квалифицированным химической капот с оперативной скоростью лица 100 футов в минуту, что обеспечивает необходимую вторичную защитную оболочку, чтобы предотвратить облучение персонала в случае аварийных утечек хлора.
- Функционирование системы при небольшом избыточном давлении (0,5 дюйма воды). Сухой воздух подается в 15 л / мин и соответствующий уровень хлора подается для достижения желаемой конечной концентрации хлора. Камеры имеют фиксирующий крышку с 4 мини-BCU замков и низкой твердомера силиконовой прокладкой, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
- Доставьте Cl 2 смесь через регулятор массового расхода. CES использует газовый баллон сжатого, содержащего 1,0% Cl 2 в атмосфере сухого азота.
- Регулировать разрежающего воздуха с помощьюспециально созданных панель управления и так же регулировать концентрацию Cl 2 доставлены в камеры облучения. Низкий объем насос отбора проб тянет выхлопных газов от камеры в анализатор хлора для мониторинга концентраций, которые затем записанные на регистратор данных, подключенный к анализатору.
- Измерение скорости потоков в камерах перед воздействием использованием расходомера, чтобы обеспечить равные скорости доставки и выхлопных газов.
- Подготовьте клеточных культур для воздействия удалением надосадочной СМИ и добавления свежей среды (базолатеральных СМИ в ALI культур). Любые виды предварительной обработки с агентами могут быть выполнены в это время.
- Expose культур Али эпителиальных клеток дыхательных путей, чтобы Cl 2 газа (50, 100 или 300 частей на миллион в течение 30 мин) в двух запечатанных полисульфоновую биоизоляции камер. Кардиомиоциты (погруженный или Конфлюэнтные культуры на мембранах) подвергаются 50 или 100 частей на миллион Cl 2 в течение 15 мин.
- После воздействия не промойте камеры с воздухом до Cл 2 уровень падает ниже 1 промилле и может быть безопасно открыт для удаления клеток (в течение 5 мин).
4. Трансэпителиального электрического сопротивления (TER) Измерение
- Измерьте TER воздушно-жидкостной-интерфейс, АЛИ, культуры, используя эпителиальный voltohmmeter с парой хлорид серебра "палочку" электродами.
- Равновесие палочку электрод в АЛИ СМИ 15 мин перед использованием.
- Добавить теплую СМИ, чтобы верхушечная (1,0 мл) и базолатеральная (2,0 мл) поверхность и измерьте TER с помощью палочки для еды электроды voltohmmeter.
- Dip более короткий рычаг электрода в апикальных сред и чем дольше руку в базолатеральной массовой информации. Нажмите кнопку "мера" на voltohmmeter оценить электрическое сопротивление.
- Voltohmmeter имеет опцию для измерения Ом или кОм. Вычтите сопротивление через поддержку культуры бесклеточной от сопротивления, измеренного на каждом клеточном слое с получением трансэпителиальных сопротивление (TER).
Каспазы измерения 5.
- Добавить свежий ALI носитель (2,0 мл) в базолатеральной поверхности после облучения и инкубировать в клетку при комнатной температуре. Сбор супернатант СМИ на 4 и 24 часов.
- Измерьте каспазы 3/7 деятельность в средствах массовой информации супернатантов с использованием коммерческого каспазы 3/7 набора для анализа.
6. Вестерн-блот и Иммуноцитохимия
- Выполните вестерн-блоттинга с использованием клеточных лизатов, как описано выше 10. Приостановить лизат белков (20 мкг) в 5-кратным сниженной буфера для образцов и кипятить в течение 5 мин. Тема белка лизата в ДСН-ПААГ (4-15%) и передать выделенные белки на нитроцеллюлозную мембрану посредством электрофореза блоттинга.
- Блок неспецифическое связывание путем инкубации мембрану с 5% молоке в промывочном буфере (PBS + 0,1% моющего средства) и зонда мембраны с первичными антителами против SERCA2 или саркомера актина в разведении 1:1000, в течение ночи при 4 ° С. Затем промыть и выдержать в мембраны с соответствующими пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами и развивать для обнаружения, как описано выше 10 с использованием коммерческого набора обнаружения пероксидазы.
- Для лечения иммуноцитохимии живые клетки, выращенные на вставками или покровные стекла в 6-луночные планшеты с 0,4% Triton-X-100 в 10 мМ буфере цитрата натрия в течение 20 мин после промывки PBS.
- Блок неспецифического связывания обработкой клеток с 5% сыворотки осла в течение 20 мин, а затем инкубируют клетки с неспецифическим IgG или отдельных первичных антител, специфичных к саркомера актина или Ki-67.
- Промывают клетки с PBS и инкубировали с флуоресцентными-конъюгированные вторичные антитела для выявления первичного антитела и окрашивающим ядра (1 мкг / мл DAPI).
- Промыть PBS и смонтировать покровные с использованием коммерческих монтажные СМИ.
- Визуализируйте окрашивание с помощью флуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичная стержневых кардиомиоциты установка на ламинином матриц и распространения и дифференцироваться в сливающихся культур (рис. 1А и его вставку). Эти клетки были дополнительно характеризуется на основе саркомера актина и выражения SERCA2 (фиг. 1В и 1С). Крыса кардиомиоциты сильно подвержены хлора токсичности как 15 мин воздействия 100 частей на миллион хлора причинили значительный округление клеток и смерть в затопленных культур и нарушению сливающихся слоев на клетках, выращенных на ламинином покрытием мембран (рис. 1D). Там также был усилен апоптоз клеток, как указано каспазы 3/7 выпуск в кардиомиоциты, выращенных на вставками (рис. 1E).
Воздействие на дифференцированный эпителий дыхательных путей человека (рис. 2, вставка в панели 1 показывает поперечное сечение клеточной культуре вставки с столбчатых, реснитчатые и бокаловидных клеток) с хлором вызвало осыпание и LIFтин клеточных мембран как при низких (100 частей на миллион) и высокий (300 частей на миллион) концентрации (рис. 2 панели A2 и A3). Повреждение при низких концентрациях хлора быстро восстанавливается (рис. 2 панели А5), однако, клетки подвергаются более высоких концентрациях хлора никогда задерживается или не ремонт способность (рис. 2 панели А6), как показано путем визуального осмотра, а также оценки клеточной пролиферации по Ki-67 окрашивания (рис. 2 панели A9). Транс эпителиальных электрическое сопротивление, измерения ТЭР и активность каспазы далее подтвердили эти результаты и представить доказательства в связи с потерей целостности мембраны и апоптоза при воздействии хлора (рис. 2, панель В и С). Таким образом, наши исследования описывают разработку Cl 2 системы экспозиции в пробирке, что вызывает потерю целостности мембраны и гибель эпителия дыхательных путей и кардиомиоцитов. Этот эффект не может быть связано с не-физиологических изменений рН в кардиомиоцитах какрН массовой информации после воздействия хлора поддерживают при ~ 7,4, как измерено с помощью рН-метра в собранном медиа после контакта.
Выделение и воздействие хлора. Кардиомиоцитах крысы Рисунок 1. Rat кардиомиоцитов выделяли, как описано в протоколе и высевали на покрытые ламинина пластиковые чашки (панель А, представитель светло микроскопические изображения) или ламинина покрытием вставками. Вставку на панели А показывает в форме палочек кардиомиоцитов распространения и дифференциации. Кардиомиоциты также характеризовались на основе саркомерные выражения актина (панель В показывая представительный образ, обнаруженную иммунофлюоресценции и Линия A панели C показывая репрезентативной сканирование вестерн-блот) и обильные выражение SERCA2 (панель C Линия B). Хлор экспозиции (100 частей на миллион 15 мин) причинили значительный гибель клеток вподводные культуры, а также нарушению клеточного монослоя на вставками (панель D показывая представительства микрофотографии). Каспазы 3/7 выпуск (панель Е) в надосадочной СМИ кардиомиоцитов, выращенных на вставками, на 4 часа и 24 ч после воздействия хлора также измеряли, как описано в тексте. Значения представляют собой средние ± SEM и * указывает значимыми (р <0,05) различие от 0 контролем промилле.
Рисунок 2. Влияние воздействия хлора на дифференцированного эпителия дыхательных путей человека воздуха и жидкой фаз (ALI) культур. Человека эпителиальные дыхательных путей базальные клетки культивировали на коллагеновых покрытием snapwells. После 5-й день верхушечный среду удаляли. Дифференцированные культуры (состоящие из базального, мерцательного, столбчатых и бокаловидных клеток, как показано на вставке к началу ЛЕФт панель панель А) подвергали воздействию хлора (100 или 300 частей на миллион) в течение 30 мин. TER была измерена и среду заменяли и клетки инкубировали в течение 24 часов. На 24 ч TER была измерена снова, и апикальный медиа собирали для измерения каспазу выпуска и клеточные мембраны были установлены для иммуногистохимического анализа. Открытая стрелка в панельных деталей А 2 и 3 показывает сбросила эпителиального слоя и черные стрелки показывают пустые пространства на вставки. Стрелка в панели часть 5 показывает регенерированного эпителий. Части 7, 8, и 9 показывают клеточная пролиферация, оцениваемых по Ki-67 иммуноокрашивания. Значения представляют собой средние ± SEM и * указывает значимыми (р <0,05) различие от 0 контролем промилле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее распространенным типом острых токсичных веществ происходит, когда один дышит ядовитый химикат в легкие. Эти химические вещества могут также быстро переносят в кровоток и может повлиять на другие органы, такие как мозг и сердце. Ингаляционная токсичность различных агентов, использующих животных моделей изучаются и сообщил широко, однако механизмы менее понятны. Это главным препятствием в разработке эффективных методов лечения. Отсутствие пробирке систем воздействия в является основной причиной отсутствия механистической идеи. Здесь мы опишем клеточных культур модели сердечной мышцы и дыхательных путей для изучения воздействия токсичных ингаляционных химических веществ, таких как воздействие хлора. Хлор быстро реагирует с водных поверхностей, образуя соляную и хлорноватистой кислоты 3,11,12. Хлор может также сочетаться с активными формами кислорода (АФК), чтобы произвести высокой реакционной способностью соединений, которые могут привести к окислению критических белков и ферментов дыхательных путей поверхности 13. Исследованияс помощью подводных культур может продемонстрировать только последствия от таких продуктов, как HOCl в случае хлора, а не самого газа. Выдержка из дифференцированных ALI культур эпителиальных клеток дыхательных путей человека, описанных здесь позволит изучение прямых взаимодействий тиков, таких как хлор с поверхности клеток в отсутствии водной среде подобных тому, что происходит в естественных условиях.
Использование первичных кардиомиоцитов крысы, мы также описать, что воздействие хлора вызывает быструю смерть клеток в затопленных культур. Эти клетки не способны расти на ALI, поскольку они не поляризуют и образуют плотные соединения. Таким образом, мы также использованы вырожденные культур, выращенных на кардиомиоцитов вставок с тонким слоем массовой информации. Воздействие этих клеточных монослоев к хлору продемонстрировали разрушение мембраны и расширение выпуска каспазы предлагая апоптоз может играть роль.
Это исследование показывает, что дыхательные пути (первичной мишенью ингаляции, которые могут быть воспроизведены ALI культурноES), а также органы, такие как сердце, что не растут на ALI могут быть изучены с помощью в пробирке систем воздействия. Эти в пробирке моделей воздействия может быть легко адаптирована для оценки последствий других токсичных химических веществ ингаляционных (тики). Используя эти модели мы ожидаем представить подробную механистический понимание токсичности и разработки новых стратегий по смягчению токсичных события, связанные с TIC / хлора, а затем оценить их дальше в естественных условиях. Хотя, эти воздействия имеют короткую продолжительность система экспозиции необходимо лучше повторить условиях культуры клеток. Воздействие газов, таких как хлор ограничивает использование влажности, поскольку это может привести к коррозии устройства. Культуры ALI может быть потрясли имитировать дыхание, как ранее использовались в нашей системе воздействие озона 14,15. Мы сейчас работаем в этих направлениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование проводится при поддержке Программы противодействия, Национального института здоровья (NIH), Канцелярии Директора и Национального института гигиены окружающей среды наук (NIEHS) номер гранта U54 ES015678 (CWW). SA также поддерживается Детской больнице Колорадо / Colorado School шахт Сотрудничество Пилот премии # G0100394 и Детская больница Колорадо Исследования Institue Пилот премии # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B.
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
