Abstract
NG2 udtrykkende celler (polydendrocytes, oligodendrocyt precursorceller) er den fjerde største gliale cellepopulation i det centrale nervesystem. Under embryonale og postnatale udvikling de aktivt formere sig og generere myelinerende oligodendrocytter. Disse celler er almindeligvis blevet undersøgt i primære dissocierede kulturer, neuron cokulturer, og i fast væv. Brug af nyligt tilgængelige transgene muselinjer skive dyrkningssystemer kan anvendes til at undersøge proliferation og differentiering af oligodendrocyt afstamning celler i både grå og hvide substans områder i forhjernen og cerebellum. Slice kulturer fremstilles ud fra tidlige postnatale mus og holdes i kultur i op til 1 måned. Disse skiver kan afbildes flere gange i løbet af kulturen periode at undersøge cellulær adfærd og interaktioner. Denne metode giver visualisering af NG2 celledeling og de skridt, der fører til oligodendrocyt differentiering, samtidig med at en detaljeret analyse af regionens-afhængigeent NG2 celle og oligodendrocyt funktionel heterogenitet. Dette er en stærk teknik, der kan anvendes til at undersøge de interne og eksterne signaler påvirker disse celler over tid i et cellulært miljø, der ligner det, der findes in vivo.
Introduction
Organoytpic skivekulturer af centralnervesystemet har vist sig at være særdeles nyttige til at studere neuron og gliacelle biologi i et semiintact system, 1 - 4. Disse kulturer er relativt enkle at vedtage og fastholde mange fordele ved primære dissocierede cellekulturer såsom manipulation af det ekstracellulære miljø og nem adgang til gentagen langsigtet levende celle billedbehandling og elektrofysiologiske optagelser 5-9. Desuden skivekulturer opretholde 3-dimensionel væv cytoarchitecture, regionalt neurale forbindelse, og de fleste større celletyper er til stede i systemet. Disse egenskaber gør disse kulturer et unikt og praktisk system til at undersøge enkelt celle adfærd og fysiologi med cellulære og miljømæssige interaktioner.
NG2 celler er en population af gliaceller i pattedyrs centralnervesystem der fortsætter med at formere sig og frembringe myelinating oligodendrocytter under embryonisk og postnatal udvikling 10. De er blevet grundigt undersøgt i dissocierede primære cellekulturer, og den seneste udvikling af transgene mus linjer med NG2 celle-specifik ekspression af fluorescerende proteiner har muliggjort in vivo skæbne kortlægning og elektrofysiologiske optagelser i akutte præparater skive. Selv med disse undersøgelser, er lidt om de tidsmæssige dynamik NG2 celleproliferation og oligodendrocyt differentiering. Selv dissocieret cellekultur er almindeligt anvendt til den relative anlæg i farmakologiske og genetiske manipulationer, er det ikke egnet til interrogering funktionelle forskelle af disse celler i forskellige områder af hjernen, især når det er ønskeligt at opretholde forbindelse med det cellulære mikromiljø. Skivekulturer giver et simpelt alternativ, der er modtagelig for farmakologiske manipulationer og er blevet anvendt til at undersøge oligodendrocyt myelinering 11,12, celleular respons efter lysolecithin (LPC) eller antistof induceret demyelinisering 13,14, og induktion af remyelinisering via farmakologisk behandling 15.
En metode til at undersøge og udføre direkte billedvisning og faste væv (eller postfiksering) analyse af NG2 celleproliferation og oligodendrocyt differentiering i organotypiske skive kulturer taget fra både forhjernen og lillehjernen er beskrevet. Dette er en kraftfuld metode, der kan bruges til at studere celle skæbne enkelte NG2 celler efter hovedgruppe 16 og at opdage områdespecifikke og aldersbetingede forskelle i vækstfaktor-induceret NG2 celleproliferation 17. Denne forholdsvis simpel teknik er bredt tilgængelige for yderligere at undersøge celle iboende og / eller miljømæssige mekanismer, der regulerer fysiologi af disse gliaceller og deres reaktion på neuronal aktivitet eller myelin skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg følger retningslinjerne, og er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Connecticut.
BEMÆRK: Til disse eksperimenter konstitutive NG2cre 18 (JAX # 008533) og inducerbare NG2creER 16 (JAX # 008538) krydsede transgene mus til Z / EG 19 (JAX # 003920) eller gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006148) linjer henholdsvis blev brugt til billedet NG2 celler og deres afkom. Til Billed modne oligodendrocytter blev PLPDsRed transgene mus 21 anvendes. Til ensartet overlevelse kan skiver isoleres fra mus op til postnatal dag 10 fra både forhjernen og cerebellum.
1. Slice Forberedelse
- I en kultur hætte, anbringe vævskultur skær i seks brønde og tilsættes 1 ml skive dyrkningsmedium (opskrift i reagenser afsnit). Sæt pladerne i cellekultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i mindst 2 timer før dissektion.
- Sterilisere alle redskaber og vævshakker med 70% ethanol.
- Bubble dissektion puffer (opskrift reagenser afsnit) med 95% O2, 5% CO2 på is i mindst 15 minutter før starten af dissektion.
- Bedøve museunger ved at placere dem på is i 5-10 minutter i henhold til godkendte dyr protokoller. Fastslå den passende dybde af anæstesi ved at bekræfte, at musene ikke reagerer på halen og tå klemme.
- Halshugge dyr under anvendelse af en skarp saks følgende animalske protokoller. Hurtigt fjerne kraniet over forhjernen og cerebellum ved først at gøre en sagittal snit efterfulgt af laterale indsnit hjælp steriliserede værktøj. Skær kranienerverne fra den ventrale overfladen af hjernen og cerebellum ved forsigtigt at rulle væv til siden.
- Placer væv i en steril 35 mm skål indeholdende iskold oxygeneret dissektion buffer.
- Ved hjælp af et barberblad, bryde lillehjernen og forhjernen. Så gør en mid-sagittal cut through forhjernen og lillehjernen, adskillelse af halvkugle.
- Skær 300 um tykke koronale og sagittale sektioner af forhjernen og lillehjernen med en manuel vævshakker. BEMÆRK: En manuel vævshakker muliggør hurtig behandling fra dissektion til kultur inkubation uden behov for agarose indlejring. En vibratome kan også anvendes som beskrevet tidligere 9.
- Overfør adskilt skiverne i frisk boblede kold dissektion buffer på is.
- Brug lille dissekere eller vejer spatler til at adskille de enkelte sektioner, og overføre dem til forinkuberet seks vel retter med kultur skær.
- Fjern overskydende dissektion buffer fra overfladen af kulturen indsatsen ved hjælp af en engangs overførselspipette eller P 200 pipettespids. To til tre forhjernen eller tre cerebellare skiver kan placeres på én kultur indsatsen.
BEMÆRK: konsistente resultater med forhjernen kulturer, er det ideelt at tage skiver spænder den forreste en tredjedel af hjernebjælken(Figur 1A) for at studere både grå og hvid substans regioner i samme skive. Hvert dyr giver normalt 6 forhjernen skiver og 6 cerebellum skiver. - Placer de seks brønde i inkubatoren og udskift skive medium med 1 ml skive medium 1 dag efter skive forberedelse og derefter hver anden dag, indtil skive fiksering.
- Afhængigt af forsøget anvender skiver efter 5-7 dage i kultur. Brug kun skiver, der bliver transparent efter de første par dage, og kassere dem, der har ujævne uigennemsigtige regioner. BEMÆRK: Mat regioner inden skiver er synlige med det blotte øje, og fremstår som en klump af mørke celler under fase kontrast. Når teknikken er blevet mestret, forekommer døde uigennemsigtige skiver sjældent i mindre end 1-5% af skiver.
2. Time-lapse Imaging af NG2 celledeling og oligodendrocyt Differentiering
BEMÆRK: For at udføre tidsforskydningen billeddannelse af NG2 celledeling og differentiering vi bruger NG2cre: ZEG mus 16som udtrykker EGFP i NG2 celler og deres afkom (Figur 1C-E). Reporter udtryk i denne linje er tilstrækkelig robust til at opnå levende billeder af GFP + celler i skiver umiddelbart efter sektionering i en periode på mindst fire uger. De klareste billeder opnås efter den indledende udtynding periode skive, hvilket sker i løbet af de første 3-5 dage i kultur.
- Gennem eksperimentet holde skiverne i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og fjerner kun i korte tidsrum (mindre end 15 min pr skive), idet låget på seks brønds plade, mens billeddannelse.
- Brug en omvendt fluorescens mikroskop udstyret med et digitalt kamera, tage billeder på det første tidspunkt ved hjælp af en 10X mål. BEMÆRK: Første gang punkter vil variere med eksperiment og kan være den dag, hvor skiverne blev fremstillet eller ethvert tidspunkt efter.
- Tag billeder fra flere regioner på tidspunkt et i både grå og hvid substans områder af skive. Note the-regionen afbildet af bestemte landmærker i skive og ved at kortlægge billedet placering på en skematisk, der kan bruges til efterfølgende billeddannelse sessioner. Nyttige vartegn kan omfatte kanter af skiver og / eller orientering af hvide substans skrifter. Billede 4-8 steder på hver skive på hvert tidspunkt.
- Optag efterfølgende billeder med et interval på 4-6 timer, hvis behandlingen NG2 celledeling og oligodendrocyt differentiering, ideelt mere end 5-7 dage.
- Optag et endeligt billede af alle regioner og løse skiver med det samme. Der tilsættes 1 ml fikseringsopløsning (4% PFA med 0,1 M L-lysin 0,01 M natrium-meta-periodat) til bunden af kulturen indsatsen, tilsæt derefter yderligere 1 ml oven på skiverne. Pas på ikke at sprøjte fiksativet direkte på skive da det kan løsne sig fra membranen. Fix vævet i 30 minutter og fortsætte med immunhistokemisk hjælp udviklingsstadiet-specifikke markører som beskrevet i afsnit 4.
- Vask skiver med 0,2 M natriumphosphatpuffer 3 x 10 m. Hvis nødvendige, store skiver ved 4 ° C i 0,2 M natriumphosphatbuffer til 1-3 dage før immunfarvning men ideelt udføre farvning inden for 24 timer. Fortsæt med immunhistokemi, som beskrevet nedenfor i afsnit 4 for at bestemme andelen af celler, der har differentieret i oligodendrocytter (figur 2D-F).
3. Skæbne Kortlægning af NG2 celle Afkom Brug Inducerbar Reporter transgene mus i skivekulturer
BEMÆRK: For at spore skæbne NG2 celler fra et bestemt tidspunkt i kulturen, inducerbare NG2creER: kan YFP transgene mus anvendes.
- Induce Cre rekombination og reporter-ekspression ved tilsætning af 100 nM 4OHT opløst i ethanol til kulturmediet. BEMÆRK: Reporter positive celler skal vises i løbet af 1-2 dage ved en induktion effektivitet ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + celler, og på dette tidspunkt vil alle være cellerne på NG2 celle stadiet (figur 2A-C)
- Fix og vask skives ved forskellige tidspunkter efter diverse manipulationer (beskrevet i punkt 2.5 og 2.6).
4. Slice Immunohistokemi
- Skær membraner med skiver fastgjort ud af indsatserne ved hjælp af en skalpel.
- Overfør udsnit til individuelle brønde i en plade med 24 brønde indeholdende phosphatbufret saltvand (PBS) ved hjælp af et sæt af pincet, pas på ikke at forstyrre sammensætningen af skive, når picking up membranen.
- Overfør skiverne til en 24-brønds plade med blokerende opløsning indeholdende 5% normalt gedeserum (NGS) og 0,1% Triton-X100 i PBS i 1 time.
- Inkubér skiver i primære antistof O / N i 5% NGS i PBS ved 4 ° C. Til identifikation af celler i NG2 celle stadiet bruge antistoffer mod NG2 og PDGFRα. Til identificering af differentierede oligodendrocytter bruge et antistof mod adenomatøs polypose coli-antigen (APC, klon CC1).
- På andendagen vask udsnit i PBS 3 x15 min, derefter inkuberes i sekundær Antibodør i 5% NGS i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Vask udsnit i PBS 3 x15 min og montere på dias. Monter med skiver op og membran overfor dias, så membranen ikke vil være mellem det objektive og vævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på repræsentative data er givet nedenfor, der er blevet opnået under anvendelse af skive kulturer fra både forhjernen og cerebellum af P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP og PLPDsRed transgene muselinjer. NG2 celler kan afbildes over dage i forhjernen og cerebellum skiver (Figur 1B-D, Video 1) og fænotype af disse celler kan bestemmes efter fiksering og immunfarvning med NG2 og CC1 antistoffer (figur 1E). Ud over at leve billeddannelse kan celleproliferation også vurderes ved hjælp af immunhistokemisk farvning for celleproliferation markører, såsom Ki67 (figur 1F). Disse data giver mulighed for en detaljeret analyse af de tidsmæssige dynamik oligodendrocyt differentiering efter NG2 celledeling på en individuel celle basis. Fate kortlægning af NG2 celler kan udføres efter induktion af cre rekombination i skiver med 4OHT i NG2creER: YFP mus (figur 2). YFP reporter-udtrykkende NG2 + celler blev found i kulturerne to dage efter tilsætning af 4OHT til dyrkningsmediet (figur 2A). Seks dage efter 4OHT induktion, havde en del af YFP + celler differentieret i CC1 + oligodendrocytter (figur 2B). Disse data viser muligheden for at udføre skæbne kortlægning af NG2 celler i skiver, hvor det ekstracellulære miljø kan manipuleres til at teste effekten af farmakologiske midler eller diverse fornærmelser på skæbne NG2 celler. Forskellige koncentrationer af 4OHT kan anvendes til at opnå forskellige grader af cre rekombination. For eksempel udsat for 100 nM 4OHT 2 dage forårsager reporter ekspression i 20-25% af alle NG2 udtrykkende celler, mens 1 uM 4OHT resulterer i cirka 60-70% rekombination effektivitet. Endelig omfattende myelin er til stede i disse kulturer, og myelinerende oligodendrocytter kan afbildes med levende og faste skiver hjælp PLPDsRed transgene mus (figur 3, Video 2).
Figur 1. Skive dyrkningsmetode til langsigtet billeddannelse af NG2 celleproliferation og differentiering (AB) Skematisk skildrer isolering af forhjernen og cerebellum udsnit (A), og efterfølgende dyrkning og time-lapse billeddannelse ved hjælp af skive kultur indsatser (B). (C ) Skildring skitserer NG2 celledeling og efterfølgende oligodendrocyt differentiering i NG2cre:. ZEG transgene mus (D) Eksempel billeder erhvervet fra kortikale regioner i NG2cre: ZEG mus viser en enkelt GFP + celle (pile) dividere to gange over en periode på 122 timer, tid afbildet i øverste højre hjørne som timer efter starten af den billeddannende eksperiment. (E) Fiksering og immunfarvning med anti-NG2 og CC1 antistoffer af den samme skive viser, at det afbildede dividing celler resulterede i tre NG2 + celler (pile). (F) Eksempel billede, der viser to Ki67 + NG2 + celler i en kortikale skive kultur. (G) Eksempel billede, der viser NG2 + celler (pilespidser) og deres processer sammenflettet med Neun + neuronale kerner i en kortikale skive kultur. Skalapanelerne 25 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Induktion af YFP udtryk at spore skæbne NG2 celler i forhjernen skivekulturer (AB) Billeder taget af hjernebjælken region forhjernen skivekulturer fra NG2creER: YFP mus behandlet med 4OHT i 24 timer og derefter til venstre i kultur i 2 dage (A) eller 6 dage (B) (A) eller CC1 og YFP (B) viser differentieringen af reporter positive NG2 celler i oligodendrocytter mens i kultur 6 dage efter cre rekombination (pil). Skalapanelerne 25 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Imaging oligodendrocytter i skivekulturer fra PLPDsRed transgene mus. (A) Skematisk skildrer isolering, dyrkning og billeddannelse af cerebellum skiver fra PLPDsRed transgene mus. (B) Billede taget fra en fast lillehjernen udsnit efter 5 dage in vitro viser calbindin + ( cyan) Purkinje neuroner med myelineredemyelinbasisprotein + (MBP) (grøn) axoner rager ind hvide substans regioner i skive. Skala Bar 25 um. (C) lav forstørrelse billeder taget fra samme region hver anden dag på de tidspunkter, der er angivet i timer i lillehjernen skivekulturer fra PLPDsRed mus. Skala Bar 100 um. (D) Lav forstørrelse billede taget fra en fast PLPDsRed skive kultur viser MBP udtryk i den hvide substans regioner, hvor dsRed + celler er koncentreret. Skala Bar 100 um. (E) Høj forstørrelse billede taget fra en fast PLPDsRed skive kultur viser enkelt dsRed + oligodendrocytter med MBP + processer. Skala Bar 20 um. (F) Time-lapse-sekvens er taget fra en PLPDsRed lillehjernen skive viser relativt stabile cellelegemer over 48 timer imaging session tid er angivet i øverste højre i timer. Skala Bar 25 um. PleaSE klik her for at se en større udgave af dette tal.
Video 1. Levende Imaging af NG2 celledeling i en kortikale skive kultur Repræsentant tid bortfalder sekvens viser flere celledelinger i en kortikale skive kultur taget fra en NG2cre:. ZEG transgene mus. Videoen vises på 5 billeder i sekundet, montage af billeder, der vises i figur 1. (Se "Video_1.mov" under Downloads)
Video 2. Levende billeddannelse af oligodendrocytter i lillehjernen skivekulturer Repræsentant tid bortfalder sekvens viser små ændringer i oligodendrocyt morfologi (pil) afbildet i løbet af 48 timer i en lillehjernen skive taget fra en PLPDsRed transgen mus. Videoen vises på 3 billeder pr sekund, montage af billeder, der vises i figur 3. (Se "Video_2.mov" under Downloads)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelinering i det centrale nervesystem er af afgørende betydning for en effektiv neuronal kommunikation og axonal overlevelse 22. NG2 celler kontinuerligt generere myelinerende oligodendrocytter ind i voksenalderen og samtidig opretholde en fastboende befolkning i de fleste områder af hjernen 16,23 - 25. Nogle genetiske og molekylære mekanismer, der regulerer differentieringen af disse celler er blevet beskrevet, men stadig meget at blive opdaget. Organotypiske skive kulturer er et praktisk værktøj til at undersøge disse mekanismer på grund af deres unikke egenskaber opretholde anatomiske regioner, let manipulation af det ekstracellulære miljø, robuste myelinering, og tilstedeværelsen af alle større celletyper. Disse karakteristika lette undersøgelsen af kort og lang sigt interaktioner mellem NG2 celler, oligodendrocytter og axoner 11,26. Desuden celletransplantation er forholdsvis let at udføre og kan anvendes til at undersøge regionen afhængig differences i celle adfærd 17. Endvidere kan farmakologiske behandlinger føjes til dyrkningsmediet at undersøge molekylære mekanismer, der påvirker NG2 celleproliferation og / eller differentiering i normal 17,27,28 og demyeliniserede kulturer 15,29. Endelig er det teknisk muligt at anvende skivekulturer at udføre skærme til high throughput analyse af forbindelser, som dirigerer NG2 celler til at formere sig eller differentiere eventuelt selv efter en demyeliniserende spot 30.
Nuværende metoder til at undersøge oligodendrocyt afstamning celler og deres samspil med axoner i en kontrolleret kultur indstilling omfatter co-kulturer med dissocieret Dorsalrodsganglieceller (DRG), eller embryonale corticale neuroner og NG2 celler 31,32, som var baseret på originale præparater udviklet til at undersøge DRG -Schwann celle interaktioner 33. Disse kulturer er blevet anvendt til at undersøge de grundlæggende egenskaber af axon og oligodendrocytafstamning celle interaktioner herunder neuronal aktivitet-afhængig signalering at inducere differentiering og myelin produktionen 32,34 - 36, ud over andre spørgsmål, såsom afhængighed af axon diameter og NG2 celledensitet kontrollerende proliferation og påbegyndelsen af differentiering 37. Mens disse cokultur systemer er ideelle til at løse sådanne spørgsmål, direkte sammenhæng og anvendelse til in vivo-situationen er ikke altid klart. Som tidligere nævnt, organotypiske skive kulturer giver en unik tilstand opretholde mange af de lokale neuronale forbindelser og tredimensionelle cytoarchitecture, der er tabt i co-kultur præparater af dissocierede celler. Desuden modsætning organotypiske skive kulturer, co-kultur systemer af dissocierede celler ofte ikke omfatte andre gliaceller og ekstracellulære matrix molekyler, der har vist sig at spille en central rolle i udvikling, vedligeholdelse og fysiologi NG2 celler, oligodendrocytterOg myelin. Med den dramatiske vækst i de mange forskellige værktøjer til rådighed for særlig mærkning og manipulation af distinkte cellepopulationer med virale vektorer og transgene dyr, langsigtet billeddannelse og skæbne kortlægning i organotypiske skive kulturer skulle vise sig at være en kraftfuld teknik til undersøgelse af NG2 celle proliferation, differentiering og oligodendrocyt myelinering.
Adskillige kritiske trin skal udføres, når du udfører disse forsøg for at sikre skive overlevelse og data reproducerbarhed. For det første bør med henblik på at frembringe sunde skiver, sektionering og isolering af skiver udføres så hurtigt som muligt og i iskold dissektion puffer. For det andet, mens automatiseret billede position erhvervelse med en motoriseret scene på fluorescens mikroskop kan være nyttigt, er der mange faktorer, der kan forstyrre den præcise flytning af regionerne afbildet og manuel gentagne opkøb er nødvendigt at få konsekvent pålidelige billeder over multiple dage. Dette er især nødvendigt, hvis skiverne er holdt i en cellekultur inkubator mellem billedoptagelse og ikke i en fase-top inkubator. For det tredje, i skive fiksering, farvning og montering er det yderst vigtigt at håndtere skiver skånsomt som en afbrydelse af væv vil resultere i manglende evne til at flytte levende billeder i områder, og celler. Der er ingen specifikke ændringer til de traditionelle metoder, der anvendes til skive kultur præparater, der bruges til undersøgelser af neuroner og astrocytter.
Der er adskillige begrænsninger for skive dyrkningsmetode, der skal overvejes. Astrocytter, mikroglia og NG2 celler vides at reagere på CNS-skade med en øget spredning på skadestedet og dannelsen af en glial ar. Fremgangsmåden til fremstilling af skiverne resulterer i nogle reorganisering og en indledende reaktiv glia respons fra disse celler. NG2 celleproliferation satser vende tilbage til niveauer svarende til dem rapporteret in vivo for matchedeudviklingsstadier efter flere dage i kultur dog af den øgede udbredelse satser og indledende reaktiv fænotype af disse celler skal overvejes, når dataene tolkning. Tilstedeværelsen af hest serum i dyrkningsmediet kan ændre NG2 celleproliferation og bør overvejes, når fortolkningen af resultaterne af forsøgene. Ud over dette, mens der er spontan neuronal aktivitet, sanseindtryk og langtrækkende forbindelser mellem neuroner mangler, som kan føre til ændret neuronal aktivitet i udsnit. Endelig, uden brug af specifikke promotor drevne virale vektorer eller transgene mus, celletype-specifikke genetiske manipulationer inden slice dyrkningssystemer er udfordrende. Selv om disse begrænsninger bør overvejes, når designe eksperimenter, skivekulturer er et unikt system, som kan udnyttes til at få ny indsigt i spørgsmål, der ikke kan besvares med dissocierede cellekulturer eller i den intakte dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
