Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
La majorité des nouvelles infections à VIH dans le monde se pose par transmission hétérosexuelle, les femmes représentent 47% des nouvelles infections en 2011 (ONUSIDA 1). Comprendre les voies génitales féminines (FGT), l'un des principaux portails d'entrée pour le VIH et d'autres agents pathogènes transmissibles sexuellement, est d'une grande importance sur la voie de trouver des stratégies efficaces pour prévenir l'infection. Les réponses immunitaires à la muqueuse génitale sont bien unique et diffèrent de celles mesurées dans le sang périphérique 2. Cependant, les connaissances actuelles de la dynamique immunitaires à la FGT est limitée au mieux. À ce jour, les études de l'environnement immunitaire muqueux ont surtout porté sur les tissus lymphoïdes associés à l'intestin (GALT), où il est devenu clair que les événements précoces dans les muqueuses après l'infection ont un fort impact sur la suite progression de la maladie 3,4. Prélèvement d'échantillons de la muqueuse génitale représente un grand défi et est au moins partiellement responsable de la lack de compréhension de l'immunologie de la FGT. Résoudre le casse-tête de la dynamique immunitaire entre l'hôte et l'agent pathogène dans le contexte de l'environnement distinct qui est la FGT nécessite des méthodes efficaces pour la collecte et l'analyse des échantillons de ce lieu.
La FGT est divisé en deux sections: l'appareil reproducteur supérieur qui comprend les trompes de Fallope, de l'endomètre et de l'endocol, et la zone inférieure qui contient l'exocol et du vagin (examiné par Kaushic et al 5). Il n'est pas encore clair que la contribution relative de ces différents sites est de l'infection à VIH, mais on pense que les deux sites pourraient contribuer à l'entrée du VIH 6. Les cellules T représentent 40 à 50% des leucocytes dans l'appareil reproducteur supérieure et inférieure, tandis que les macrophages constituent environ 10% (passage en revue dans Rodriguez-Garcia et al 2). Les cellules T peuvent être détectés dans le vagin, le col utérin et de l'endomètre. Les macrophages sont plus fortement localized dans l'endomètre et du tissu conjonctif du myomètre que le col de l'utérus, mais ils peuvent être détectés dans les deux tissus. Enfin, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) et les cellules de Langerhans peuvent également être détectés dans les tissus de traitement des fumées. Le phénotype et les proportions des populations immunitaires et leur susceptibilité à l'infection à VIH peuvent varier surtout selon des cycles hormonaux, l'utilisation de contraceptifs hormonaux, la vaginose bactérienne ou des activités sexuelles 5,7-9.
Diverses méthodes ont été développées pour étudier les populations immunitaires et de l'environnement de la FGT. Biopsie cervicale, cytobrosses col de l'utérus et des lavages cervico-vaginales (CVL) 10-12 sont le plus couramment utilisé dans la littérature. Collection CVL par PBS lavage est la méthode la plus simple et permet l'étude des protéines immunomodulateurs, mais les résultats du rendement des cellules extrêmement faible, et n'est donc pas adapté à l'étude des populations de cellules immunitaires de la FGT 13. Échantillons CVL sont, d'autre part, vEry utile pour évaluer l'environnement à l'abri de la FGT par mesure de l'expression de différentes cytokines, les chimiokines ou les facteurs anti-microbiens à l'aide de méthodes telles que l'ELISA, tableau cytokine de talon 14 ou la spectrométrie de masse 15,16. Caractérisation des fréquences des cellules immunitaires, les phénotypes et des fonctions peut être obtenue en collectant les cellules mononucléaires du col (CMC) par cytobrosse col de l'utérus ou de l'échantillonnage de biopsie cervicale.
L'échantillonnage de biopsie cervicale est une méthode invasive qui augmente l'inconfort et le risque de saignement et prend de 2 à 11 jours pour guérir suivant le mode opératoire en fonction de l'état immunitaire de la femme 12. D'autre part, cytobrosses cervicales, en dépit de la baisse de rendement des cellules recueillies, est un moyen moins invasif et plus commode de recueillir les cellules immunitaires de l'FGT. Les deux méthodes peuvent atteindre le même rendement de leucocytes CD45 +, mais deux cytobrosses cervicales séquentielles sont nécessaires pour obtenir la même quantité de cellules contenues in une biopsie 13. Néanmoins, cytobrosse échantillonnage fournit encore un nombre acceptable de cellules (environ 5000 CD45 + cellules / de cytobrosse) pour plus d'ex vivo phénotypage en cytométrie de flux 14. De plus, la caractérisation fonctionnelle peut être réalisée sur ces échantillons, comme la stimulation et le flux intracellulaire par cytométrie ou qPCR ont été effectuées en utilisant les CMC de cytobrosse dérivé d'identifier les réponses immunitaires spécifiques au VIH 17 ou la polarisation de la cellule Th 18. L'expansion de la population de cellules T peut également faciliter les études fonctionnelles avec CMC 19.
Il est important de noter que les biopsies et cytobrosses échantillonnent des parties distinctes de la FGT. Les biopsies sont obtenues à partir de la partie supérieure de l'épithélium et le stroma de l'exocol 12,13, tandis que cytobrosses cervicales échantillonnent l'orifice utérin, la collecte des cellules dérivées de l'épithélium de l'endocol et vraisemblablement la zone de transformation. Échantillons cytobrosse donc goûter une nouvellerégion composée d'une seule couche de l'épithélium cylindrique, tandis que les biopsies, comprennent une région bordée par un épithélium pavimenteux stratifié 5. Par conséquent, la nature des populations leucocytaires recueillies par biopsie cervicale et cytobrosse diffère. Les biopsies de recueillir une plus grande proportion de cellules T CD3 +, alors que cytobrosses se traduisent par une collection de plus grande proportion de monocytes CD14 + / 13 macrophages.
L'étude de l'immunologie de la FGT a eu un intérêt pour de nombreuses années 20-22 et nous avons accumulé beaucoup d'expertise à l'étude des CMC de cytobrosse dérivés. Nos études portent principalement sur l'étude des infectés par le VIH, non infecté et exposés au VIH séronégatifs (Hesn) femmes travailleuses du sexe de Nairobi, au Kenya. Le VIH se réplique préférentiellement dans les cellules T activées 23 et inférieure du nombre de cellules activées qui peuvent être ciblées par le VIH dans le FGT pourraient contribuer à la protection contre la contamination par le VIH. En accord avec cette hypothèse, plusieurs studies ont décrit l'activation immunitaire plus faible parmi les travailleurs du sexe de Hesn qui sont très exposés au VIH restent encore non infectées 24,25, et ce phénotype de repos est également observée dans le FGT 14. Ici, nous décrivons la méthodologie pour le traitement et l'évaluation des cellules T activation dans des échantillons provenant de CMC cytobrosses col de l'utérus par ex vivo cytométrie de flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compte tenu des grandes lacunes dans les connaissances à l'égard de l'immunité à l'appareil génital féminin (FGT), analyse phénotypique de CMC peut fournir un large éventail de points de vue dans les populations de lymphocytes multiples au col. Couplée à l'analyse protéomique et des mesures de la charge virale dans le lavage de l'utérus, l'immunité aux infections sexuellement transmissibles (IST s) et d'autres agents pathogènes peut être disséqué dans diverses populations. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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