Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
La maggior parte delle nuove infezioni da HIV in tutto il mondo nascono attraverso la trasmissione eterosessuale, con le donne rappresentano il 47% delle nuove infezioni nel 2011 (UNAIDS 1). Comprendere il tratto genitale femminile (FGT), uno dei principali portali di ingresso per l'HIV e di altri agenti patogeni a trasmissione sessuale, è di grande importanza nel cammino per trovare strategie efficaci per prevenire l'infezione. Risposte immunitarie alla mucosa genitale sono chiaramente unico e differiscono da quelli misurati nel sangue periferico 2. Tuttavia, l'attuale conoscenza delle dinamiche immunodeficienza al FGT è limitata al meglio. Ad oggi, gli studi di ambiente immunitario della mucosa hanno in gran parte concentrata sui tessuti linfoidi dell'intestino associato (GALT), dove è diventato chiaro che i primi eventi nei tessuti della mucosa seguenti infezioni hanno un forte impatto sulla successiva progressione della malattia 3,4. Raccolta dei campioni dalla mucosa genitale rappresenta una grande sfida ed è almeno parzialmente responsabile del lack di comprensione della immunologia del FGT. Risolvere il puzzle della dinamica immunitario tra ospite e patogeno nel contesto dell'ambiente distinto che è il FGT richiede metodi efficienti per raccogliere e analizzare campioni di questo locale.
Il FGT è divisa in due sezioni: il tratto riproduttivo superiore che comprende le tube di Falloppio, endometrio e endocervice, e il tratto inferiore che contiene la portio e la vagina (recensito da Kaushic et al 5). Non è ancora chiaro quanto il contributo relativo di questi diversi siti è all'HIV, ma si ritiene che entrambi i siti possono contribuire a voce HIV 6. Cellule T rappresentano il 40-50% dei leucociti nei tratti riproduttivi superiori e inferiori, mentre macrofagi costituiscono circa il 10% (recensito in Rodriguez-Garcia et al 2). Cellule T possono essere rilevati nella vagina, cervice e dell'endometrio. I macrofagi sono più fortemente Localized nell'endometrio e tessuto connettivo miometrio rispetto alla cervice, anche se possono essere rilevati in entrambi i tessuti. Infine, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) e cellule di Langerhans possono essere rilevati anche nei tessuti FGT. Il fenotipo e proporzioni delle popolazioni immunitarie e la loro suscettibilità alle infezioni da HIV possono variare importante secondo cicli ormonali, l'uso di contraccettivi ormonali, vaginosi batterica o attività sessuali 5,7-9.
Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare le popolazioni immunitarie e l'ambiente del FGT. Biopsia cervicale, cytobrushes cervicale e lavaggi cervico-vaginale (CVL), 10-12 sono i più comunemente utilizzato in tutto il letteratura. Collezione CVL da PBS lavanda è il metodo più semplice e permette lo studio delle proteine modulatori immunitari, ma i risultati del rendimento delle cellule estremamente basso, e quindi non è adatto per studiare le popolazioni di cellule immunitarie del FGT 13. Campioni CVL sono, invece, very utili per valutare l'ambiente immunitario del FGT misurando l'espressione di diverse citochine, chemochine o fattori antimicrobici usando metodi quali ELISA, citochine branello matrice 14 o spettrometria di massa 15,16. Caratterizzazione delle frequenze di cellule immunitarie, fenotipi e funzioni può essere ottenuto mediante prelievo di cellule mononucleate cervicali (CMC) da cytobrush cervicale o mediante campionamento biopsia cervicale.
Campionamento biopsia cervicale è un metodo invasivo che aumenta il disagio e rischio di sanguinamento e richiede 2 a 11 giorni per guarire seguendo la procedura a seconda dello stato immunitario della donna 12. D'altra parte, cytobrushes cervicali, nonostante la minore resa di cellule raccolte, è un metodo meno invasivo e più conveniente per raccogliere le cellule immunitarie dal FGT. Entrambi i metodi possono raggiungere la stessa resa di leucociti CD45 +, ma due cytobrushes cervicali sequenziali sono necessari per avere la stessa quantità di cellule contenute in una biopsia 13. Tuttavia, il campionamento cytobrush fornisce ancora un numero accettabile di cellule (cellule + circa 5.000 CD45 / cytobrush) per ulteriore ex vivo fenotipizzazione mediante citometria di flusso 14. Inoltre, la caratterizzazione funzionale può essere effettuata su questi campioni, la stimolazione e flusso intracellulare citometria o qPCR sono state effettuate utilizzando CMC cytobrush derivate per identificare HIV-specifiche risposte immunitarie 17 o polarizzazione cellulare Th 18. L'espansione della popolazione di cellule T può anche facilitare gli studi funzionali con CMC 19.
È importante notare che le biopsie e cytobrushes campionare porzioni distinte della FGT. Biopsie sono derivati dalla porzione superiore del epitelio e stroma della portio 12,13, mentre cytobrushes cervicali campionare della cervice, raccogliendo cellule derivate dall'epitelio di endocervice e presumibilmente la zona di trasformazione. Campioni Cytobrush quindi degustare un regione composto da un unico strato di epitelio colonnare, mentre biopsie, comprendono una regione rivestita da un epitelio squamoso stratificato 5. Di conseguenza, la natura delle popolazioni di leucociti raccolti da biopsia cervicale e cytobrush differisce. Biopsie raccolgono una percentuale maggiore di cellule T CD3 +, mentre cytobrushes comportano la raccolta di una maggiore percentuale di monociti CD14 + / macrofagi 13.
Studiare la immunologia della FGT è stato un interesse per molti anni 20-22 e abbiamo accumulato una grande esperienza con lo studio della CMC cytobrush-derivati. I nostri studi si concentrano principalmente sullo studio del virus HIV-infetti, non infetto e HIV-esposti sieronegativi (HESN) i lavoratori di sesso femminile da Nairobi, Kenya. HIV si replica preferenzialmente nelle cellule T attivate 23 e inferiore numero di cellule attivate che possono essere avviati da HIV nel FGT potrebbero contribuire alla protezione contro l'acquisizione HIV. In linea con questa ipotesi, diversi studies hanno descritto attivazione immunitaria più bassa tra i lavoratori di sesso HESN che sono altamente esposti al virus HIV ancora rimanere infetto 24,25, e questo fenotipo quiescente si osserva anche nel FGT 14. Qui, descriviamo la metodologia per l'elaborazione e la valutazione cellule T di attivazione nei campioni CMC derivati da cytobrushes cervicali da ex vivo citometria a flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Date le grandi lacune nella conoscenza per quanto riguarda l'immunità al tratto genitale femminile (FGT), analisi fenotipica di CMC in grado di fornire una vasta gamma di intuizioni più popolazioni linfocitarie alla cervice. Accoppiato con l'analisi proteomica e le misurazioni della carica virale di lavanda cervicale, l'immunità alle infezioni sessualmente trasmissibili (IST) s ed altri agenti patogeni può essere sezionato in varie popolazioni.
Considerazioni tecniche…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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