Коллекция, Изоляция и проточной цитометрии анализа человеческой Endocervical образцов
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
Большинство новых случаев ВИЧ-инфекции во всем мире возникают в результате гетеросексуальных контактов, при этом женщины, представляющая 47% новых случаев инфицирования в 2011 году (ЮНЭЙДС 1). Понимание женский генитальный тракт (Fgt), один из главных порталов входа для ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем, имеет большое значение на пути к поиску эффективных стратегий для предотвращения инфекции. Иммунный ответ на слизистой оболочки половых органов, очевидно, уникальным и отличаться от тех, измеренный в периферической крови 2. Однако современные знания иммунных динамики на FGT ограничивается в лучшем случае. На сегодняшний день исследования слизистой иммунной среде в значительной степени сосредоточена на кишечником лимфоидной ткани (Галт), где стало ясно, что ранние события в слизистые ткани следующие инфекции оказывают сильное влияние на последующее прогрессирования заболевания 3,4. Сбор образцов из слизистой оболочки половых органов представляет собой серьезную проблему, и по меньшей мере частично ответственным за LacК от понимания иммунологии FGT. Решение головоломки иммунной динамике между организмом хозяина и возбудителем в контексте отдельной среде, FGT требует эффективных методов сбора и анализа образцов из этой местности.
FGT делится на две части: верхняя репродуктивного тракта, что включает в себя маточные трубы, эндометрий и канала шейки матки, а нижний тракт, который содержит Ectocervix и влагалище (обзор Kaushic др. 5). До сих пор неясно, что относительный вклад этих различных сайтов к ВИЧ-инфекции, но считается, что оба сайта может способствовать проникновения ВИЧ 6. Т-клетки представляют 40-50% лейкоцитов в верхних и нижних половых путей, в то время как макрофаги содержат приблизительно 10% (обзор в Rodriguez-Garcia и др. 2). Т-клетки могут быть обнаружены в влагалища, шейки матки и матки. Макрофаги сильнее Localiзет в эндометрии и соединительной ткани миометрия, чем шейки матки, хотя они могут быть обнаружены в обеих тканях. Наконец, плазмацитоидных дендритные клетки (ЦПК) и клетки Лангерганса также могут быть обнаружены в НАШИ АДРЕСА тканей. Фенотип и пропорции иммунных населения и их восприимчивости к ВИЧ-инфекции может варьироваться главное соответствии с гормональными циклами, использование гормональных контрацептивов, бактериального вагиноза или сексуальные действия 5,7-9.
Разнообразные методы были разработаны для изучения иммунной населения и окружающей среды FGT. Рак шейки биопсия, шейные cytobrushes и цервиковагинальная орошений (ЛПМ) 10-12 являются наиболее часто используется во литературе. Коллекция ЛПМ на PBS промывания является самым простым методом и позволяет изучение иммунных модуляторных белков, но приводит к чрезвычайно низким выходом клеток, и поэтому не подходит для изучения популяций иммунных клеток на FGT 13. Образцы масел и АКБ являются, с другой стороны, обERy полезен для оценки иммунного среду FGT путем измерения экспрессии различных цитокинов, хемокинов или антимикробных факторов с использованием методов, таких как ELISA, цитокин борта массива 14 или масс-спектрометрии 15,16. Характеристика частот иммунных клеток, фенотипов и функций может быть достигнуто путем сбора мононуклеарных клеток шейки матки (CMC) шейки щеточкой Cytobrush или путем отбора проб биопсией шейки матки.
Выборки шейки биопсия инвазивный метод, который увеличивает дискомфорт и риск кровотечения и занимает от 2 до 11 дней, чтобы залечить после процедуры в зависимости от иммунного статуса женщины 12. С другой стороны, рак шейки cytobrushes, несмотря на более низкий выход клеток, собранных, является менее инвазивным и более удобный способ для сбора иммунных клеток из FGT. Оба метода могут достичь такого же выход CD45 + лейкоцитов, но два последовательных шейки cytobrushes необходимы для получения такого же количества клеток, содержащихся ян один биопсия 13. Тем не менее, отбор проб цитощеточка еще обеспечивает приемлемый количество клеток (около 5000 CD45 + клеток / цитощеточка) для дополнительной экс естественных фенотипирования с помощью проточной цитометрии 14. Кроме того, функциональные характеристики можно проводить на этих образцах, как стимулирование и внутриклеточный проточной цитометрии или КПЦР были выполнены с использованием цитощеточка полученных КМЦ, чтобы определить ВИЧ-специфические иммунные реакции 17 или Th клеток поляризацию 18. Расширение клеток населения T может также облегчить функциональные исследования с ОМЦ 19.
Важно отметить, что биопсии и cytobrushes образец различных частей FGT. Биопсии получены из верхней части эпителия и стромы Ectocervix 12,13, в то время шейки cytobrushes пробовать шейки матки, сбор клеток, полученных из эпителия канала шейки матки и, предположительно зоны трансформации. Следовательно, с образцами цитощеточка попробовать повторноГион состоит из одного слоя цилиндрического эпителия, в то время биопсии, включать область выстлана плоскоклеточный многослойного эпителия 5. В результате, природа популяций лейкоцитов, собранных цервикальной биопсии и щеточкой Cytobrush отличается. Биопсия собрать более высокую долю CD3 + Т-клеток, в то время как cytobrushes привести к коллекции более высокая доля CD14 + моноциты / макрофаги 13.
Изучение иммунологии FGT был интерес на протяжении многих лет 20-22, и мы накопили огромный опыт с изучением цитощеточка полученных СМС. Наши исследования сосредоточены в основном на изучении ВИЧ-инфицированных, неинфицированных и ВИЧ-инфицированными серонегативных (HESN) работница секс от Найроби, Кения. ВИЧ преимущественно размножается в активированных Т-клеток 23 и меньшее число активированных клеток, которые могут быть мишенью ВИЧ в FGT могли бы способствовать защите от заражения ВИЧ. В соответствии с этой гипотезой, несколько Studiэс описали низкую иммунную активацию среди HESN работников секс-бизнеса, которые подвергаются высокому ВИЧ еще остаются неинфицированных 24,25, и это в состоянии покоя фенотип наблюдается также в FGT 14. Здесь мы описываем методологию для обработки и оценки Т-клеток активации в образцах CMC, полученных из шейки матки cytobrushes экс естественных проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
С учетом больших пробелов в знаниях в отношении иммунитета в женских половых путей (ФГТ), фенотипическая анализ ОМЦ может обеспечить широкий спектр идеи на несколько популяций лимфоцитов на шейке матки. В сочетании с протеомного анализа и измерений вирусной нагрузки в шейном промыван?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- . UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
