Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
La mayoría de las nuevas infecciones por el VIH en todo el mundo surgen a través de la transmisión heterosexual, las mujeres representan el 47% de las nuevas infecciones en 2011 (ONUSIDA 1). Entender el tracto genital femenino (FGT), uno de los principales portales de entrada para el VIH y otros agentes patógenos de transmisión sexual, es de gran importancia en el camino hacia la búsqueda de estrategias eficaces para prevenir la infección. Las respuestas inmunes en la mucosa genital son claramente únicas y difieren de los medidos en la sangre periférica 2. Sin embargo, los conocimientos actuales de la dinámica del sistema inmune en el FGT se limita, en el mejor. Hasta la fecha, los estudios sobre el medio ambiente inmune de la mucosa se han centrado en gran medida en los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), donde se ha convertido en claro que los primeros eventos en los tejidos de las mucosas después de la infección tienen un fuerte impacto en la progresión de la enfermedad posterior 3,4. Recogida de muestras de la mucosa genital representa un gran desafío y es al menos parcialmente responsable de la lack de comprensión de la inmunología de la FGT. Resolviendo el rompecabezas de la dinámica inmunitaria entre el huésped y el patógeno en el contexto del entorno distinto que es el FGT requiere métodos eficaces para la recogida y análisis de muestras de esta localidad.
El FGT se divide en dos secciones: el tracto reproductivo superior que incluye las trompas de Falopio, endometrio y endocérvix, y el tracto inferior que contiene el exocérvix y la vagina (revisado por Kaushic et al 5). Aún no está claro lo que la contribución relativa de estos diferentes sitios es a la infección por el VIH, pero se cree que ambos sitios podrían contribuir a la entrada del VIH 6. Células T representan el 40-50% de los leucocitos en los tractos reproductivos superior e inferior, mientras que los macrófagos comprenden aproximadamente el 10% (revisado en Rodríguez-García et al 2). Las células T pueden ser detectados en la vagina, el cuello uterino, y endometrio. Los macrófagos son más fuertemente localizeta en el endometrio y el tejido conectivo del miometrio que el cuello del útero, a pesar de que se pueden detectar en ambos tejidos. Por último, las células dendríticas plasmacitoides (PDC) y células de Langerhans también pueden ser detectados en los tejidos de TGC. El fenotipo y proporciones de poblaciones inmunes y su susceptibilidad a la infección por el VIH pueden variar importante de acuerdo a los ciclos hormonales, el uso de anticonceptivos hormonales, la vaginosis bacteriana o actividades sexuales 5,7-9.
Diversos métodos se han desarrollado para estudiar las poblaciones inmunes y el medio ambiente de la FGT. Biopsia cervical, cepillados cervicales y lavados cervicovaginales (CVL) 10-12 son los más utilizados en toda la literatura. Colección CVL por PBS lavado es el método más simple y permite el estudio de proteínas inmunomoduladoras, pero los resultados en rendimiento extremadamente bajo de células, y por lo tanto no es adecuado para el estudio de las poblaciones de células inmunes del TGC 13. Muestras CVL son, por otra parte, VEry útil para evaluar el entorno inmunológico del TGC mediante la medición de la expresión de diversas citoquinas, quimioquinas o factores antimicrobianos utilizando métodos tales como ELISA, de bolas de serie de citoquinas 14 o espectrometría de masas 15,16. Caracterización de las frecuencias de células inmunes, fenotipos y funciones se puede lograr mediante la recopilación de las células mononucleares de cuello uterino (CMC) por citocepillo cervical o mediante la toma de muestras de biopsia cervical.
Toma de muestras de biopsia de cuello uterino es un método invasivo que aumenta el malestar y el riesgo de sangrado y tarda de 2 a 11 días en sanar después del procedimiento, dependiendo del estado inmunológico de la mujer 12. Por otro lado, cepillados cervicales, a pesar de la menor rendimiento de las células recogidas, es un método menos invasivo y más conveniente para recoger las células inmunes de la TGC. Ambos métodos pueden alcanzar el mismo rendimiento de leucocitos CD45 +, pero dos cepillados cervicales secuenciales son necesarias para obtener la misma cantidad de células contenidas in una biopsia 13. Sin embargo, el muestreo citocepillo todavía proporciona un número aceptable de células (células CD45 + sobre 5000 / citocepillo) para obtener más fenotipificación ex vivo mediante citometría de flujo 14. Además, la caracterización funcional puede llevarse a cabo en estas muestras, como se han realizado la estimulación y citometría de flujo intracelular o qPCR utilizando CMC cytobrush derivados para identificar respuestas inmunes específicas para el VIH 17 o polarización de las células Th. 18. La expansión de la población de células T también puede facilitar los estudios funcionales con CMC 19.
Es importante tener en cuenta que las biopsias y cepillados muestrean porciones distintas de la TGC. Las biopsias se derivan de la parte superior del epitelio y el estroma del exocérvix 12,13, mientras cepillados cervicales muestrean del orificio cervical, la recolección de células derivadas del epitelio del endocérvix y, presumiblemente, la zona de transformación. Por lo tanto, las muestras citocepillo muestrean una reregión compone de una sola capa de epitelio cilíndrico, mientras que las biopsias, incluyen una región de la línea por un epitelio escamoso estratificado 5. Como resultado, la naturaleza de las poblaciones de leucocitos recogidos por biopsia cervical y citocepillo difiere. Las biopsias recogen una mayor proporción de células T CD3 +, mientras que cepillados resultan en la colección de una mayor proporción de monocitos CD14 + / macrófagos 13.
El estudio de la inmunología de la FGT ha habido un interés por muchos años 20-22 y hemos acumulado una gran experiencia con el estudio de los CMC cytobrush derivados. Nuestros estudios se centran principalmente en el estudio de la infección por el VIH, no infectados y expuestos al VIH seronegativos (HESN) trabajadoras sexuales de Nairobi, Kenia. El VIH se replica preferentemente en células T activadas 23 e inferior del número de células activadas que pueden ser dirigidos por el VIH en el TGC podrían contribuir a la protección contra la adquisición del VIH. De acuerdo con esta hipótesis, varios studies han descrito la activación inmune más baja entre los trabajadores del sexo HESN que están altamente expuestos al VIH aún permanecen infectados 24,25 y este fenotipo quiescente se observa también en el TGC 14. Aquí se describe la metodología para la elaboración y evaluación de la activación de células T en muestras de CMC derivados de cepillados cervicales por ex vivo citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dadas las grandes lagunas de conocimiento con respecto a la inmunidad en el tracto genital femenino (FGT), el análisis fenotípico de los CMC puede proporcionar una amplia gama de puntos de vista en varias poblaciones de linfocitos en el cuello uterino. Junto con el análisis proteómico y mediciones de carga viral en el lavado de cuello de útero, la inmunidad a las infecciones de transmisión sexual (ITS) s y otros patógenos puede ser diseccionado en varias poblaciones.
Considera…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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