جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
غالبية الإصابات الجديدة بفيروس نقص المناعة البشرية في جميع أنحاء العالم من خلال نقل تنشأ الغيرية، وتمثل النساء 47٪ من الإصابات الجديدة في عام 2011 (برنامج الأمم المتحدة المشترك 1). فهم المسالك التناسلية للإناث (FGT)، واحدة من بوابات الدخول الرئيسية لفيروس نقص المناعة البشرية وغيره من مسببات الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي، له أهمية كبيرة على طريق إيجاد استراتيجيات فعالة لمنع العدوى. الاستجابات المناعية في الغشاء المخاطي التناسلية بشكل واضح فريدة من نوعها وتختلف عن تلك التي قيست في الدم المحيطي 2. ومع ذلك، والمعرفة الحالية لديناميات المناعة في FGT يقتصر في أحسن الأحوال. حتى الآن، ركزت دراسات البيئة المناعة المخاطية إلى حد كبير على الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (GALT)، حيث أصبح من الواضح أن الأحداث في وقت مبكر من الأنسجة المخاطية بعد الإصابة يكون لها تأثير قوي على تطور المرض لاحقا 3،4. جمع عينات من الغشاء المخاطي التناسلية يمثل تحديا كبيرا، وهي مسؤولة جزئيا على الأقل في أمريكا اللاتينية والكاريبيك من فهم علم المناعة من FGT. حل اللغز من ديناميكية المناعة بين المضيف والممرض في سياق البيئة المتميزة التي هو FGT يتطلب أساليب فعالة لجمع وتحليل عينات من هذه اللغة.
ينقسم FGT إلى قسمين: الجهاز التناسلي العلوي الذي يتضمن أنابيب فالوب، بطانة الرحم وباطن عنق الرحم، والجهاز الذي يحتوي على أقل الجزء المهبلي من العنق والمهبل (استعرضها Kaushic آخرون 5). فإنه لا يزال من غير الواضح ما المساهمة النسبية لهذه المواقع المختلفة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، ولكن يعتقد أن كلا الموقعين يمكن أن تسهم في إدخال فيروس نقص المناعة البشرية 6. خلايا T تمثل 40-50٪ من كريات الدم البيضاء في مساحات الإنجابية العلوي والسفلي، في حين تضم ما يقرب من 10٪ الضامة (إعادة النظر في رودريغيز غارسيا، وآخرون 2). ويمكن الكشف عن خلايا T في المهبل وعنق الرحم وبطانة الرحم و. الضامة هي أكثر locali بقوةزد في بطانة الرحم والنسيج الضام عضلة الرحم من عنق الرحم، على الرغم من أنها يمكن أن يتم الكشف عن في كل الأنسجة. أخيرا، الخلايا الجذعية بلازماوية (pDCs) وخلايا لانغرهانس يمكن أيضا أن يتم الكشف عن FGT في الأنسجة. النمط الظاهري ونسب السكان المناعة، وقابليتها للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية قد تختلف الأهم وفقا لدورات الهرمونية، واستخدام وسائل منع الحمل الهرمونية، التهاب المهبل الجرثومي أو أنشطة جنسية 5،7-9.
وقد تم تطوير أساليب متنوعة لدراسة السكان والبيئة المناعي من FGT. خزعة عنق الرحم، وعنق الرحم وcytobrushes lavages العنقية المهبلية (CVL) 10-12 هي الأكثر استخداما عبر الأدب. جمع CVL بواسطة PBS غسل هو أبسط طريقة ويسمح دراسة البروتينات المناعية تغييري ولكن النتائج في العائد خلية منخفضة للغاية، وبالتالي فهي ليست مناسبة لدراسة السكان الخلايا المناعية من FGT 13. عينات CVL هي، من ناحية أخرى، والخامسريها مفيدة لتقييم البيئة المناعي للFGT عن طريق قياس التعبير عن مختلف السيتوكينات، كيموكينات أو عوامل مضادة للميكروبات باستخدام أساليب مثل ELISA، خلوى حبة مجموعة 14 أو قياس الطيف الكتلي 15،16. لا يمكن أن يتحقق توصيف الترددات الخلايا المناعية، والظواهر وظائف الخلايا وحيدات النوى من خلال جمع عنق الرحم (CMC) من خلال عنق الرحم cytobrush أو عنق الرحم أخذ عينات الخزعة.
عنق الرحم أخذ عينات الخزعة هو أسلوب الغازية التي تزيد من مشقة وخطر النزيف ويأخذ 2-11 أيام للشفاء بعد إجراء اعتمادا على الوضع المناعي للمرأة 12. من ناحية أخرى، cytobrushes عنق الرحم، على الرغم من انخفاض العائد من الخلايا التي تم جمعها، هو وسيلة أقل الغازية وأكثر ملاءمة لجمع الخلايا المناعية من FGT. كلتا الطريقتين يمكن الوصول إلى نفس العائد من كريات الدم البيضاء CD45 +، ولكن اثنين cytobrushes عنق الرحم متتابعة ضرورية للحصول على نفس الكمية من الخلايا الموجودة طن واحد خزعة 13. مع ذلك، وأخذ العينات cytobrush لا يزال يوفر عددا مقبولا من خلايا (CD45 + حوالي 5،000 خلية / cytobrush) لمزيد من فيفو السابقين phenotyping بواسطة التدفق الخلوي 14. أيضا، وتوصيف وظيفي يمكن القيام بها على هذه العينات، حيث تم تنفيذ التحفيز وتدفق الخلايا الخلوي أو باستخدام QPCR المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush لتحديد الاستجابات المناعية فيروس نقص المناعة البشرية محددة 17 أو الاستقطاب الخلية ال 18. قد توسع من السكان الخلايا التائية أيضا تسهيل الدراسات الفنية مع المجالس البلدية للأطفال 19.
من المهم أن نلاحظ أن الخزعات وcytobrushes عينة أجزاء متميزة من FGT. وتستمد الخزعات من الجزء العلوي للظهارة وسدى من الجزء المهبلي من العنق 12،13، في حين cytobrushes عنق الرحم أخذ عينات من فوهة عنق الرحم، وجمع الخلايا المشتقة من ظهارة باطن عنق الرحم ويفترض أن منطقة التحول. لذا عينات عينة Cytobrush إعادةجيون تتألف من طبقة واحدة من ظهارة عمودية، في حين الخزعات، وتشمل منطقة مبطنة من قبل ظهارة الحرشفية الطبقية 5. ونتيجة لذلك، فإن طبيعة السكان الكرية البيضاء التي جمعتها خزعة عنق الرحم وcytobrush يختلف. الخزعات جمع نسبة أعلى من الخلايا CD3 + T، في حين cytobrushes يؤدي إلى مجموعة من نسبة أعلى من حيدات CD14 + / 13 الضامة.
وكانت دراسة علم المناعة من FGT مصلحة لسنوات عديدة 20-22 وتراكمت لدينا قدرا كبيرا من الخبرة مع دراسة المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush. تركز دراساتنا في الغالب على دراسة المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وغير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية تتعرض سلبيين (الحصن) عاملات الجنس من نيروبي، كينيا. فيروس نقص المناعة البشرية يعيد تفضيلي في تنشيط خلايا تي 23 وانخفاض أعداد خلايا تنشيط التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل فيروس نقص المناعة البشرية في FGT يمكن أن تسهم في الحماية من فيروس نقص المناعة البشرية الاستحواذ. تمشيا مع هذه الفرضية، عدة ستوديوقد وصفت وفاق تنشيط جهاز المناعة أقل بين العاملات في تجارة الجنس الحصن الذين يتعرضون للغاية لفيروس نقص المناعة البشرية لا تزال حتى الآن غير مصاب 24،25، ويلاحظ هذا النمط الظاهري هادئة أيضا في FGT 14. هنا، نحن تصف منهجية لمعالجة وتقييم تفعيل الخلايا التائية في عينات CMC المستمدة من cytobrushes عنق الرحم بواسطة فيفو السابقين التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا للفجوات كبيرة في المعرفة فيما يتعلق بالحصانة في المسالك التناسلية للإناث (FGT)، ويمكن تحليل المظهري من المجالس البلدية للأطفال توفر مجموعة واسعة من نظرة ثاقبة السكان اللمفاويات متعددة في عنق الرحم. إلى جانب تحليل البروتين والقياسات الحمل الفيروسي في غسل عنق الر?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- . UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
