Indsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale prøver

Summary

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Abstract

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introduction

Hovedparten af de nye hiv-smittede på verdensplan opstå gennem heteroseksuel transmission, med kvinder, der repræsenterer 47% af nye infektioner i 2011 (UNAIDS ^1). Forståelse af kvindelige kønsorganer (FGT), en af ​​de vigtigste indgange portaler for HIV og andre seksuelt overførte patogener, er af stor betydning på vejen til at finde effektive strategier til at forebygge infektion. Immunrespons på genitale slimhinder er klart enestående og adskiller sig fra dem, der måles i perifert blod ^2. Dog er aktuelle viden immun dynamik på FGT begrænset i bedste fald. Til dato har studier af slimhindeimmunsystemet miljø i høj grad fokuseret på de tarmassocieret lymfevæv (GALT), hvor det er blevet klart, at de tidlige begivenheder i mucosavæv efter infektion har en kraftig indvirkning på den efterfølgende sygdomsprogression ^3,4. Indsamling af prøver fra det genitale slimhinder udgør en stor udfordring, og er i det mindste delvist ansvarlig for lack forståelse af immunologi i FGT. Løse puslespillet af immun dynamik mellem vært og patogen i forbindelse med den særskilte miljø, der er FGT nødvendiggør effektive metoder til indsamling og analyse af prøver fra denne lokalitet.

Den FGT er opdelt i to sektioner: den øverste forplantningskanal der omfatter æggeledere, endometrium og endocervix samt lavere tarmkanalen, som indeholder ectocervix og vagina (gennemgået af Kaushic m.fl. ^5). Det er stadig uklart, hvad det relative bidrag af disse forskellige sites er at HIV-infektion, men det menes, at begge steder kan bidrage til HIV indgang ^6. T-celler udgør 40-50% af leukocytterne i de øvre og nedre reproduktive skrifter, mens makrofager udgør ca 10% (revideret i Rodriguez-Garcia m.fl. ^2). T-celler kan påvises i skeden, livmoderhalsen og endometriet. Makrofager er stærkere localized i endometriet og myometrisk bindevæv end livmoderhalsen, selv om de kan påvises i begge væv. Endelig kan plasmacytoid dendritiske celler (PDCs) og Langerhanske celler også påvises i FGT væv. Fænotype og proportioner immun befolkninger og deres modtagelighed over for hiv-infektion kan variere vigtigere efter hormonelle cyklus, brug af hormonel prævention, bakteriel vaginose eller seksuelle aktiviteter ^5,7-9.

Der er udviklet forskellige metoder til at studere immun befolkninger og miljø i FGT. Cervikal biopsi, livmoderhalskræft cytobrushes og cervicovaginal udskylninger (CVL) ^10-12 er de mest almindeligt anvendte over litteraturen. CVL samling af PBS udskylning er den enkleste metode og tillader undersøgelse af immun modulerende proteiner, men resulterer i ekstremt lave celleudbytte og er derfor ikke egnet til at studere immun cellepopulationer af FGT ^13. CVL prøver er på den anden side, modery nyttige til at evaluere immune miljø FGT ved måling af ekspression af forskellige cytokiner, chemokiner eller antimikrobielle faktorer ved hjælp af metoder såsom ELISA, cytokin bead matrix ¹⁴ eller massespektrometri ^15,16. Karakterisering af immuncelletyper frekvenser, fænotyper og funktioner kan opnås ved at samle cervikale mononukleære celler (CMC) ved cervikal cytobrush eller ved cervikal biopsi prøveudtagning.

Cervikal biopsi prøveudtagning er en invasiv metode, der øger ubehag og risiko for blødning og tager 2 til 11 dage for at helbrede følge fremgangsmåden afhængigt immunstatus kvinde ^12. På den anden side, cervikale cytobrushes, til trods for lavere udbytte af opsamlede celler, er en mindre invasiv og mere bekvem metode til at indsamle immunceller fra FGT. Begge metoder kan nå det samme udbytte af CD45 + leukocytter, men to sekventielle cervikale cytobrushes er nødvendige for at opnå den samme mængde celler indeholdt in en biopsi ^13. Alligevel cytobrush prøveudtagning giver stadig et acceptabelt antal celler (ca. 5.000 CD45 + celler / cytobrush) for yderligere ex vivo fænotypebestemmelse ved flowcytometri ^14. Desuden kan funktionel karakterisering udføres på disse prøver, som stimulering og intracellulær flowcytometri eller qPCR blevet udført under anvendelse cytobrush afledt CMCs at identificere HIV-specifikke immunresponser ¹⁷ eller Th cellepolarisering ^18. Udvidelse af T-celler befolkning kan også lette funktionelle undersøgelser med CMCs ^19.

Det er vigtigt at bemærke, at biopsier og cytobrushes prøve forskellige dele af FGT. Biopsier er afledt fra den overlegne del af epitel og stroma af ectocervix ^12,13, mens cervikale cytobrushes prøve cervikale OS, indsamling af celler afledt af epithelium endocervix og formentlig overgangszonen. Cytobrush prøver derfor prøve en reregion består af et enkelt lag af søjleepitel, mens biopsier, omfatter en region foret med en skællede stratificeret epitel ^5. Som et resultat, arten af ​​leukocyt populationer indsamlet ved cervikal biopsi cytobrush forskellig. Biopsier indsamle en højere andel af CD3 + T-celler, hvorimod cytobrushes resulterer i opsamling af en højere andel af CD14 + monocytter / makrofager ^13.

Studere immunologi af FGT har været en interesse i mange år ^20-22, og vi har oparbejdet en stor ekspertise med studiet af cytobrush afledt CMCs. Vore undersøgelser fokuserer primært på studiet af hiv-smittede, inficerede og HIV-eksponerede seronegative (HESN) kvindelige prostituerede fra Nairobi, Kenya. HIV fortrinsvis replikerer i aktiverede T-celler ²³ og lavere antal af aktiverede celler, der kan målrettes ved hiv i FGT kan bidrage til beskyttelse mod hiv erhvervelse. I overensstemmelse med denne hypotese, flere Studies har beskrevet lavere immunaktivering blandt HESN sexarbejdere, der er højt eksponeret for HIV alligevel forblive inficerede ^24,25, og dette fredfyldte fænotype er også observeret i FGT ^14. Her beskriver vi metoder til behandling og vurdering af T-celler aktivering i CMC prøver stammer fra cervikale cytobrushes ved ex vivo flowcytometri.

Protocol

Etik erklæring: De forskningsetik bestyrelser både University of Manitoba og Kenyatta National Hospital / University of Nairobi godkendt denne undersøgelse og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere. 1.. Udarbejdelse af Medier og CMC Collection Tubes Forbered phosphatbufret saltvand (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCI, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2PO 4). Autoklave for sterilitet. Dette kan opbevares ved 4 …

Representative Results

Multiparameter flowcytometri er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de fænotyper og funktioner celleundersæt i tidligere ukarakteriserede væv. Analyse af CMC prøver kan give oplysninger om både lymfocyt-og monocyt populationer med passende gating strategier. En repræsentant CMC gating strategi i forhold til en matchet PBMC profil, er vist i figur 2. FSC-A versus FSC-H plot tillader udelukkelse af celle-dubletter, som er meget udbredt i CMC prøver sammenlignet med…

Discussion

I betragtning af de store huller i viden med hensyn til immunitet på kvindelige kønsorganer (FGT) kan fænotypisk analyse af CMCs levere en bred vifte af indsigt i flere lymfocytpopulationer på livmoderhalsen. Kombineret med proteom analyse og virusbelastningsrespons målinger i livmoderhalskræft udskylning, kan immunitet over for seksuelt overførte infektioner (STI) s og andre patogener dissekeres i forskellige populationer.

Tekniske overvejelser – CMCs: Den isolation …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant