संग्रह, अलगाव, और मानव endocervical नमूने का प्रवाह cytometric विश्लेषण
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
नए एचआईवी संक्रमण के बहुमत दुनिया भर में महिलाओं के लिए 2011 में (यूएनएड्स 1) नए संक्रमण के 47% का प्रतिनिधित्व करने के साथ, विषमलैंगिक प्रसारण के माध्यम से उत्पन्न होती हैं. महिला जननांग पथ (FGT), एचआईवी और अन्य यौन संचारित रोगजनकों के लिए मुख्य प्रवेश पोर्टलों में से एक को समझना, संक्रमण को रोकने के लिए कारगर रणनीति पाने की राह पर उच्च महत्व का है. जननांग म्यूकोसा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्पष्ट रूप से अद्वितीय हैं और परिधीय रक्त 2 में मापा उन लोगों से अलग. हालांकि, FGT में प्रतिरक्षा गतिशीलता की मौजूदा ज्ञान पर सबसे अच्छा सीमित है. तिथि करने के लिए, mucosal प्रतिरक्षा पर्यावरण की पढ़ाई काफी हद तक यह संक्रमण के बाद mucosal ऊतकों में जल्दी घटनाओं बाद रोग प्रगति 3,4 पर एक मजबूत प्रभाव है कि स्पष्ट हो गया है, जहां पेट जुड़े lymphoid ऊतकों (GALT), पर ध्यान केंद्रित किया है. जननांग म्यूकोसा से नमूने इकट्ठा करने के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है और लाख के लिए कम से कम आंशिक रूप से जिम्मेदार हैFGT के इम्यूनोलॉजी की समझ का कश्मीर. FGT इस स्थान से नमूने इकट्ठा करने और विश्लेषण करने के लिए कारगर तरीकों में जरूरी है कि अलग वातावरण के संदर्भ में मेजबान और रोगज़नक़ के बीच प्रतिरक्षा गतिशील की पहेली को सुलझाने.
FGT दो वर्गों में बांटा गया है: फैलोपियन ट्यूब, अंतर्गर्भाशयकला और अंतर्गर्भाशयग्रीवा, और बहिर्जरायुग्रीवा होता है जो निचले पथ और योनि भी शामिल है कि ऊपरी प्रजनन पथ (Kaushic द्वारा समीक्षा एट अल 5). यह इन अलग अलग साइटों के सापेक्ष योगदान एचआईवी संक्रमण के लिए है क्या अभी भी स्पष्ट नहीं है, लेकिन यह दोनों साइटों एचआईवी प्रविष्टि 6 में योगदान कर सकता है कि माना जाता है. टी कोशिकाओं मैक्रोफेज (रोड्रिगेज-गार्सिया में समीक्षा एट अल 2) लगभग 10% शामिल है, जबकि ऊपरी और निचले प्रजनन इलाकों में ल्यूकोसाइट के 40-50% का प्रतिनिधित्व करते हैं. टी कोशिकाओं योनि, गर्भाशय ग्रीवा, और अंतर्गर्भाशयकला में पता लगाया जा सकता है. मैक्रोफेज और अधिक मजबूती locali हैंवे दोनों के ऊतकों में पाया जा सकता है, गर्भाशय ग्रीवा से अंतर्गर्भाशयकला और myometrial संयोजी ऊतक में जेड. अंत में, plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) और Langerhans कोशिकाओं को भी FGT ऊतकों में पाया जा सकता है. phenotype और प्रतिरक्षा आबादी और एचआईवी संक्रमण के लिए अपनी संवेदनशीलता का अनुपात हार्मोनल चक्र के अनुसार महत्वपूर्ण बात भिन्न हो सकते हैं, हार्मोनल गर्भ निरोधकों, बैक्टीरियल vaginosis या यौन गतिविधियों 5,7-9 का उपयोग.
विविध तरीकों FGT की प्रतिरक्षा आबादी और पर्यावरण अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. सरवाइकल बायोप्सी, ग्रीवा cytobrushes और cervicovaginal lavages (CVL) 10-12 सबसे अधिक साहित्य भर में इस्तेमाल कर रहे हैं. पीबीएस पानी से धोना द्वारा CVL संग्रह सरलतम विधि है और बेहद कम सेल उपज में प्रतिरक्षा modulatory प्रोटीन लेकिन परिणाम के अध्ययन की अनुमति देता है, और इसलिए FGT 13 की प्रतिरक्षा सेल आबादी के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है. CVL नमूने, दूसरे हाथ पर, v रहे हैंऐसे एलिसा, साइटोकाइन मनका सरणी 14 या मास स्पेक्ट्रोमेट्री 15,16 जैसे तरीकों का उपयोग विभिन्न साइटोकिन्स, chemokines या रोगाणुरोधी कारकों की अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा FGT की प्रतिरक्षा पर्यावरण के मूल्यांकन के लिए उपयोगी ery. प्रतिरक्षा सेल आवृत्तियों, phenotypes और कार्यों की विशेषता ग्रीवा cytobrush से या गर्भाशय ग्रीवा बायोप्सी नमूना द्वारा गर्भाशय ग्रीवा कोशिकाओं mononuclear (सीएमसी) को इकट्ठा करके प्राप्त किया जा सकता है.
सरवाइकल बायोप्सी नमूना रक्तस्राव की बेचैनी और खतरा बढ़ जाता है और महिला को 12 साल की प्रतिरक्षा स्थिति के आधार पर प्रक्रिया के बाद चंगा करने के लिए 2-11 दिन लगते हैं कि एक आक्रामक तरीका है. दूसरी ओर, ग्रीवा cytobrushes, एकत्र कोशिकाओं की कम उपज के बावजूद, FGT से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक कम आक्रामक और अधिक सुविधाजनक तरीका है. दोनों तरीकों CD45 + ल्यूकोसाइट की ही उपज तक पहुँच सकते हैं, लेकिन दो अनुक्रमिक ग्रीवा cytobrushes निहित कोशिकाओं का एक ही राशि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं मैंn एक बायोप्सी 13. बहरहाल, cytobrush नमूने अभी भी 14 प्रवाह cytometry से आगे पूर्व vivo phenotyping के लिए कोशिकाओं का एक स्वीकार्य संख्या (लगभग 5,000 CD45 + कोशिकाओं / cytobrush) प्रदान करता है. उत्तेजना और intracellular प्रवाह cytometry या qPCR एचआईवी विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 17 या वें सेल ध्रुवीकरण 18 की पहचान करने के लिए cytobrush व्युत्पन्न CMCs का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है के रूप में इसके अलावा, कार्यात्मक विशेषता, इन नमूनों पर किया जा सकता है. टी कोशिकाओं की आबादी का विस्तार भी CMCs 19 के साथ कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा हो सकती है.
यह बायोप्सी और cytobrushes FGT के विशिष्ट भागों का नमूना है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. ग्रीवा cytobrushes अंतर्गर्भाशयग्रीवा और शायद परिवर्तन क्षेत्र के उपकला से ली गई कोशिकाओं को इकट्ठा करने, गर्भाशय ग्रीवा ओएस नमूना जबकि बायोप्सी, बहिर्जरायुग्रीवा 12,13 के उपकला और stroma के बेहतर भाग से निकाली गई है. Cytobrush नमूने इसलिए फिर से एक नमूनाबायोप्सी, एक स्क्वैमस स्तरीकृत उपकला 5 से अटे एक क्षेत्र शामिल हैं, जबकि इलाके, खानेदार उपकला की एक परत से बना. नतीजतन, ग्रीवा बायोप्सी और cytobrush द्वारा एकत्र श्वेतकोशिका आबादी की प्रकृति अलग है. Cytobrushes CD14 + monocytes / मैक्रोफेज 13 के एक उच्च अनुपात के संग्रह में परिणाम जबकि बायोप्सी, CD3 + टी कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात इकट्ठा.
FGT के इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के कई साल 20-22 के लिए एक ब्याज कर दिया गया है और हम cytobrush व्युत्पन्न CMCs के अध्ययन के साथ विशेषज्ञता का एक बड़ा सौदा जमा किया है. हमारी पढ़ाई, एचआईवी संक्रमित असंक्रमित और एचआईवी उजागर seronegative नैरोबी, केन्या से (HESN) महिला यौनकर्मियों के अध्ययन पर ज्यादातर ध्यान केंद्रित. एचआईवी preferentially FGT में एचआईवी से लक्षित किया जा सकता है कि सक्रिय कोशिकाओं के 23 और कम संख्या एचआईवी के अधिग्रहण के खिलाफ संरक्षण के लिए योगदान कर सकता सक्रिय टी कोशिकाओं में replicates. इस परिकल्पना, कई Studi के साथ लाइन मेंतों अभी तक 24,25 असंक्रमित बने हुए हैं, और इस मौन phenotype भी FGT 14 में मनाया जाता है अत्यधिक एचआईवी के संपर्क में हैं जो HESN यौनकर्मियों के बीच कम प्रतिरक्षा सक्रियण का वर्णन किया है. यहाँ, हम प्रसंस्करण के लिए पद्धति का वर्णन और पूर्व vivo प्रवाह cytometry द्वारा गर्भाशय ग्रीवा cytobrushes से व्युत्पन्न सीएमसी नमूनों में टी कोशिकाओं सक्रियण का आकलन.
Protocol
Representative Results
Discussion
महिला जननांग पथ (FGT) में प्रतिरक्षा करने के लिए सम्मान के साथ ज्ञान में बड़े अंतराल को देखते हुए, CMCs के प्ररूपी विश्लेषण ग्रीवा में कई लिम्फोसाइट आबादी में अंतर्दृष्टि की एक विस्तृत सरणी प्रदान कर सकते ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
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