人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
世界中の新たなHIV感染の大半は（UNAIDS 1）2011年に新たな感染の47％に相当女性と、異性間感染によって起こる。女性の生殖器（FGT）、HIVやその他の性感染性病原体のメインエントリポータルの1を理解すること、感染症を予防するための効率的な戦略を見つけることへのパスに非常に重要である。性器粘膜での免疫応答は、明らかに固有のものであり、末梢血2で測定されたものとは異なる。しかし、FGTの免疫動態の現在の知識は、最高の状態で制限されています。現在までに、粘膜免疫環境の研究は、主としてそれが感染後に粘膜組織における初期事象は、その後の疾患の進行3,4に強い影響を有することが明らかとなった腸管関連リンパ組織（GALT）に焦点を当ててきた。性器粘膜からサンプルを収集することは大きな課題であるとLACのために少なくとも部分的に責任があるFGTの免疫学の理解のK。 FGTはこのロケールからサンプルを収集し、分析するための効率的な方法が必要とされている特定の環境のコンテキストでのホストと病原体との間に免疫のダイナミックのパズルを解く。
FGTは2つのセクションに分かれています卵管、子宮内膜および子宮頚内膜が含まれ、上部生殖管および子宮膣部が含まれている下気道と膣（Kaushicによって審査ら 5）。これは、これらの異なる部位の相対的寄与はHIV感染症であるものはまだ不明であるが、両方の部位がHIVエントリー6に寄与し得ると考えられている。マクロファージ（ロドリゲス·ガルシアら 2に概説されている）約10％を構成しながら、T細胞は、上部および下部生殖管における白血球の40〜50％を表す。 T細胞は、膣、子宮頚部、および子宮内膜中で検出することができる。マクロファージはより強くlocaliですそれらが両方の組織で検出することができるが、子宮内膜および子宮頸部より子宮筋層の結合組織にゼット。最後に、形質細胞様樹状細胞（pDC）およびランゲルハンス細胞もFGT組織において検出することができる。表現型および免疫人口やHIV感染に対する感受性の割合がホルモンサイクルに応じて重要なのは異なる場合があり、ホルモン避妊薬、細菌性膣炎や性的活動5,7-9の使用。
多様な方法がFGTの免疫集団と環境を研究するために開発されてきた。子宮頸部生検、子宮頸cytobrushesと頸膣洗浄液（CVL）10月12日は、最も一般的に文献全体で使用されています。 PBSの洗浄によるCVLコレクションは、最も簡単な方法であり、極めて低い細胞収量の免疫調節タンパク質が、結果の研究を可能にするため、FGT 13の免疫細胞集団を研究するためには適していない。 CVLサンプルは、一方で、νある例えば、ELISA、サイトカインビーズアレイ14 15,16または質量分析などの方法を用いて種々のサイトカイン、ケモカインまたは抗菌因子の発現を測定することにより、FGTの免疫環境を評価するのに有用ERY。免疫細胞の頻度、表現型および機能の特徴付けは、子宮頸部細胞採取用ブラシによって、または子宮頸部生検サンプリングによって子宮頸部単核細胞（CMC）を収集することによって達成することができる。
子宮頸部生検標本は、出血の不快感や危険性を高めると女12の免疫状態に応じて、手順に従って癒すために2から11日かかる侵襲的な方法である。一方、子宮頸cytobrushesは、採取した細胞のより低い利回りにもかかわらず、FGTから免疫細胞を収集するための低侵襲、より便利な方法である。両方の方法は、CD45 +白血球の同じ収率に達することができるが、二つの連続子宮頸部cytobrushesが含まれる細胞と同じ量を得るために必要であるiをN 1の生検13。それにもかかわらず、細胞採取用ブラシのサンプリングは、まだ14フローサイトメトリーによるさらなるex vivoでの表現型解析のための細胞の許容数（約5000 CD45 +細胞/細胞採取用ブラシ）を提供します。刺激および細胞内フローサイトメトリーまたは定量PCRは、HIV特異的免疫応答17又はTh細胞の分極18を識別するために、細胞採取用ブラシ由来のCMCを使用して実施されているように、また、機能的な特徴付けは、これらの試料上で行うことができる。 T細胞集団の拡大はまた、CMCを19と機能的研究を容易にすることができる。
それは、生検およびcytobrushesはFGTの異なる部分をサンプリングしていることに注意することが重要である。子宮頸cytobrushesは子宮頸部、おそらく移行帯の上皮由来の細胞を集め、子宮口をサンプリングしながら、生検、子宮膣部12,13の上皮と間質の優れた部分に由来している。細胞採取用ブラシのサンプルは、そのための再サンプリング生検は、扁平重層上皮5によって裏打ち領域を含み、一方祇園は、円柱上皮の単層からなる。その結果、子宮頸部生検および細胞採取用ブラシによって収集白血球集団の性質が異なっている。 cytobrushesは、CD14 +単球/マクロファージ13の割合が高くのコレクションになるのに対し、生検では、CD3 + T細胞の割合が高く集める。
FGTの免疫学を研究することは、長年にわたって20〜22関心されており、我々は細胞採取用ブラシ由来のCMCの研究と専門知識の多くを蓄積してきました。我々の研究は、ケニアのナイロビからのHIVに感染し、感染していないと、HIV-曝露反応陰性（HESN）女性セックスワーカーの研究に主に焦点を当てています。 HIVは優先的にFGTでHIVの標的とすることができる活性化された細胞の23と下部の数字は、HIVの獲得に対する保護に貢献できる活性化したT細胞で複製。この仮説に沿って、いくつかのストゥディESは非常にHIVにさらされているHESNのセックスワーカーの免疫活性化は、まだ感染していない24,25まま下に記載されており、この静止表現型はまた、FGT 14で観察される。ここでは、処理のための方法論を記載し、ex vivoでフローサイトメトリーによって子宮頸部cytobrushes由来CMCサンプル中のT細胞の活性化を評価する。
Protocol
Representative Results
Discussion
女性の生殖器（FGT）の免疫に関する知識に大きなギャップを考えると、CMCで表現型分析は、子宮頸部の複数のリンパ球集団への洞察の広い配列を提供することができます。プロテオーム解析と子宮頸洗浄液中のウイルス量の測定と相まって、性感染症（STI）Sおよび他の病原体に対する免疫は、様々な集団で解剖することができます。
技術的な考慮-のCMC：CMC…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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