Insamling, Isolering och flödescytometrisk analys av Human endocervikala prover

Summary

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Abstract

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introduction

Majoriteten av nya hiv-infektioner i världen uppstår genom heterosexuell överföring, med kvinnor som representerar 47% av nya infektioner under 2011 (UNAIDS ^1). Att förstå det kvinnliga könsorgan (FGT), en av de viktigaste ingångsportaler för hiv och andra sexuellt överförbara patogener, är av stor betydelse på vägen till att finna effektiva strategier för att förhindra infektion. Immunsvar på genitalslemhinnan är klart unik och skiljer sig från de som mäts i perifert blod ^2. Dock är aktuell kunskap om immun dynamiken på FGT begränsad i bästa fall. Hittills har studier av slemhinnor immun miljön i hög grad fokuserat på tarmassocierad lymfvävnad (GALT), där det har blivit tydligt att de tidiga händelserna i slemhinnevävnader efter infektion har en stark inverkan på efterföljande sjukdomsutveckling ^3,4. Samla prover från genitalslemhinnan är en stor utmaning och är åtminstone delvis ansvarig för lack förståelse för immunologi i FGT. Lösa pussel av immun dynamik mellan värd och patogen i samband med den distinkta miljö som är FGT kräver effektiva metoder för insamling och analys av prover från den här lokalen.

Den FGT är uppdelad i två delar: den övre reproduktiva tarmkanalen som inkluderar äggledarna, livmoderslemhinnan och endocervix samt nedre tarmkanalen som innehåller ectocervix och slidan (granskad av Kaushic m.fl. ^5). Det är fortfarande oklart vad den relativa betydelsen av dessa olika platser är att HIV-infektion, men man tror att båda sidor skulle kunna bidra till HIV posten ^6. T-celler som representerar 40-50% av leukocyterna i de övre och nedre fortplantningsvägarna, medan makrofager utgör cirka 10% (översikt i Rodriguez-Garcia et al, ^2). T-celler kan detekteras i vagina, livmoderhalsen och livmoderslemhinnan. Makrofager är starkare localized i endometriet och myometrial bindväv än livmoderhalsen, även om de kan detekteras i båda vävnaderna. Slutligen kan plasmacytoid dendritiska celler (PDCs) och Langerhans celler också påvisas i FGT vävnader. Den fenotyp och proportioner av immuna populationer och deras mottaglighet för HIV-infektion kan variera allt beroende på hormonella cykler, användning av hormonella preventivmedel, bakteriell vaginos eller sexuella aktiviteter ^5,7-9.

Olika metoder har utvecklats för att studera immun populationer och miljö i FGT. Cervikal biopsi, cervical cytobrushes och livmoderhals lavages (CVL) ^{från 10 till 12} är det mest använda i hela litteraturen. CVL samling av PBS lavage är den enklaste metoden och tillåter studier av immunmodulerande proteiner, men resulterar i extremt låga cellutbyte, och är därför inte lämplig för att studera immuncellpopulationer i FGT ^13. CVL prover är, å andra sidan, vEry användbara för att utvärdera immun miljön i FGT genom att mäta uttryck av olika cytokiner, kemokiner eller antimikrobiella faktorer med användning av metoder såsom ELISA, cytokin bead array ¹⁴ eller masspektrometri ^15,16. Karaktärisering av immuncellfrekvenser, fenotyper och funktioner kan åstadkommas genom att samla in cervical mononukleära celler (CMC) genom cervikal cytobrush eller genom cervikal biopsi provtagning.

Cervikal biopsiprovtagning är en invasiv metod som ökar obehag och risk för blödning och tar 2 till 11 dagar att läka genom att följa förfarandet beroende på immunstatus hos kvinnan ^12. Å andra sidan, cervical cytobrushes, trots den lägre utbyte av celler som samlats in, är en mindre invasiv och mera bekväm metod för att samla immunceller från FGT. Båda metoderna kan nå samma avkastning av CD45 + leukocyter, men två sekventiella livmoderhalscancer cytobrushes är nödvändigt för att få samma mängd celler innehöll in en biopsi ^13. Icke desto mindre erbjuder cytobrush provtagning fortfarande ett acceptabelt antal celler (omkring 5000 CD45 + celler / cytobrush) för ytterligare ex vivo fenotypning med flödescytometri ^14. Dessutom kan funktionell karakterisering utföras på dessa prover, såsom stimulering och intracellulär flödescytometri eller qPCR har utförts med användning av cytobrush härledda CMCs att identifiera HIV-specifika immunsvar ¹⁷ eller Th cell polarisering ^18. Expansion av T-celler populationen kan också underlätta funktionella studier med CMC ^19.

Det är viktigt att notera att biopsier och cytobrushes sampla distinkta partier av FGT. Biopsier är härledda från den överlägsna delen av epitel och stroma ectocervix ^12,13, medan livmoder cytobrushes sampla livmodermunnen, samla celler härledda från epitel endocervix och förmodligen transformationszonen. Cytobrush prover sampla därför en region består av ett enda skikt av kolumnär epitel, medan biopsier, inkludera en region kantas av en skvamös stratifierat epitel ^5. Som ett resultat skiljer sig den typ av leukocyt-populationer som samlats genom cervikal biopsi och cytobrush. Biopsier samla en större andel av CD3 + T-celler, medan cytobrushes resultera i uppsamling av en större andel av CD14 + monocyter / makrofager ^13.

Att studera immunologi i FGT har varit ett intresse i många år ^20-22 och vi har samlat ett stort kunnande med studiet av cytobrush-härledda CMC. Våra studier fokuserar främst på studier av HIV-smittade, oinfekterade och HIV-exponerade seronegativa (HESN) kvinnliga prostituerade från Nairobi, Kenya. HIV replikerar företrädesvis i aktiverade T-celler ²³ och lägre antal aktiverade celler som kan riktas av HIV i FGT kan bidra till skydd mot HIV-förvärvet. I linje med denna hypotes, flera studies har beskrivits lägre immunaktivering bland HESN prostituerade som är mycket utsatta för HIV ändå förbli oinfekterade ^24,25, och det vilande fenotyp är också observerats i FGT ^14. Här beskriver vi metod för beredning och bedömning av T-celler aktiveras i CMC-prov härledda från cervikala cytobrushes genom ex vivo flödescytometri.

Protocol

Etik uttalande: De forskningsetiska styrelser både University of Manitoba och Kenyatta National Hospital / Nairobis universitet godkände studien och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla studiedeltagare. 1. Beredning av media och CMC Collection Tubes Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav för sterilitet. Detta kan förvaras vid 4 ° C i fler…

Representative Results

Multi flödescytometri är ett kraftfullt verktyg för att dissekera de fenotyper och funktioner cellgrupper i tidigare okarakteriserade vävnader. Analys av CMC prover kan ge information om både lymfocyter och monocytpopulationernas med lämpliga grindstrategier. En representant CMC gating strategi, jämfört med en matchad PBMC profil, visas i figur 2. FSC-A kontra FSC-H tomten medger uteslutning av cell dubbletter, som är mycket vanliga i CMC-prover jämfört med PBMC, …

Discussion

Med tanke på de stora kunskapsluckor när det gäller immunitet vid det kvinnliga könsorgan (FGT), kan fenotypisk analys av CMC maskiner ger ett brett spektrum av insikter i flera lymfocytpopulationer vid livmoderhalsen. Tillsammans med proteomik analyser och virusmängd mätningar i livmodersköljning, kan immunitet mot sexuellt överförbara infektioner (STI) s och andra patogener dissekeras i olika populationer.

Tekniska överväganden – CMC: Isolering och framgångsrik…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant