Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
Yeni HIV enfeksiyonlarının çoğunluğu dünya çapında kadınların 2011 yılında (UNAIDS 1) yeni enfeksiyonların% 47 temsil ile, heteroseksüel iletim yoluyla ortaya çıkar. Kadın genital (FGT), HIV ve diğer cinsel yolla bulaşan patojenler için ana giriş portallarından birini anlamak, enfeksiyonu önlemek için etkili stratejiler bulmak için yolda yüksek önem taşımaktadır. Genital mukoza bağışıklık karşılıkları da açık bir şekilde benzersiz ve periferik kan 2 ölçülen farklıdır. Ancak, FGT de bağışıklık dinamikleri mevcut bilgi en iyi sınırlıdır. Bugüne kadar, mukozal bağışıklık çevre çalışmaları büyük ölçüde enfeksiyonu takiben mukozal dokularda erken olaylar sonraki hastalığın ilerlemesi 3,4 üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu açık hale gelmiştir gut-ilişkili lenfoid dokularda (GALT), odaklanmıştır. Genital mukoza numune toplama büyük bir sorun teşkil etmektedir ve lak için en azından kısmen sorumludurFGT ve immünoloji anlayış k. FGT bu yerel örnekler toplamak ve analiz etmek için etkili yöntemler gerektiren olan farklı çevre bağlamında ev sahibi ve patojen arasındaki bağışıklık dinamiğin bulmaca çözme.
FGT iki bölüme ayrılır: fallop tüpleri, endometrium ve endoserviksten ve ektoservikste içeren alt sistem ve vajina içeren üst üreme yolları (Kaushic tarafından gözden vd 5). Bu farklı sitelerde nispi katkısı HIV enfeksiyonuna ne hala belirsiz olduğunu, ancak her iki site HIV girişi 6 katkı verebilecek düşünülmektedir. T hücreleri, makrofajlar (Rodriguez-Garcia et al yorumlanan 2) yaklaşık 10% 'sini, üst ve alt üreme yolları olarak lökositlerin% 40-50 temsil eder. T hücreleri, vajina, rahim ve endometriyumda tespit edilebilir. Makrofajlar, daha güçlü olan localiher ikisi de dokularda tespit edilebilir, ancak, serviks daha endometriyum ve myometrial bağ dokusunda zed. Son olarak, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ve Langerhans hücreleri de FGT dokularda tespit edilebilir. Fenotip ve bağışıklık nüfus ve HIV enfeksiyonuna karşı duyarlılık oranları hormonal döngülerine göre önemlisi değişebilir, hormonal kontraseptifler, bakteriyel vajinozis veya cinsel faaliyetler 5,7-9 kullanımı.
Çeşitli yöntemler FGT bağışıklık nüfus ve çalışma ortamı için geliştirilmiştir. Servikal biyopsi, servikal cytobrushes ve servikovaginal lavajlar (CVL) 10-12 en sık literatürde genelinde kullanılmaktadır. PBS lavaj ile CVL toplama en kolay metodu olarak ve son derece düşük bir hücre verimle immün modülatör proteinlerin ancak sonuç çalışma sağlar ve bu nedenle FGT 13'ün bağışıklık hücresi popülasyonlarının çalışmak için uygun değildir. CVL örnekleri, diğer taraftan, v olanELISA, sitokin boncuk dizi 14 ya da kütle spektrofotometresi 15,16 gibi yöntemler kullanılarak, çeşitli sitokinler, kemokinler ya da antimikrobiyal faktörlerin ekspresyonunu ölçerek FGT bağışıklık çevre değerlendirmek için yararlı ery. Immün hücre frekansları, fenotipler ve işlevleri karakterizasyonu servikal cytobrush veya servikal biyopsi örnekleme ile servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplanması ile elde edilebilir.
Servikal biyopsi örnekleme kanama rahatsızlık ve riskini artırır ve kadının 12 bağışıklık durumuna bağlı olarak prosedürü takip iyileşmek için 2 ila 11 gün sürer invaziv bir yöntemdir. Öte yandan, servikal cytobrushes toplandı, hücre alt verim rağmen FGT bağışık hücreleri toplamak için daha az invaziv ve daha uygun bir yöntemdir. Her iki yöntem de CD45 + lökositlerin aynı verimi ulaşabilir, ancak iki ardışık servikal cytobrushes ihtiva ettiği hücre aynı miktarda elde etmek için gerekli olan in bir biyopsi 13. Bununla birlikte, yine, 14 numune cytobrush akış sitometrisi ile daha da ex vivo feno hücre kabul edilebilir bir sayısı (yaklaşık 5000 CD45 + hücre / cytobrush) sağlamaktadır. Uyarılması ve hücre içi akış sitometrisi veya QPCR HIV spesifik immün tepkilerini 17 ya da hücre Th polarizasyonunu 18 tespit etmek cytobrush türevli CMC kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiş olarak aynı zamanda, fonksiyonel karakterizasyonu, bu numuneler üzerinde ifa edilebilir. T hücreleri nüfusunun genişleme aynı zamanda CMC lerin 19 ile işlevsel çalışmalar kolaylaştırabilir.
Bu biyopsiler ve cytobrushes FGT belirgin bölümlerini örnek olduğuna dikkat etmek önemlidir. Servikal cytobrushes endoserviksten ve muhtemelen transformasyon bölgesinin epitel türetilen hücrelerin toplanması, serviks örnek ise biyopsileri, ektoservikste 12,13 epiteli ve stroma üstün kısmından türetilmiştir. Cytobrush örnekler bu nedenle yeniden örnekbiyopsiler, bir skuamöz tabakalı epitelyum 5 ile kaplı bir bölge dahil ederken gion, kolumnar epitel tek bir tabaka oluşur. Bunun bir sonucu olarak, servikal biyopsi ve cytobrush tarafından toplanan lökosit popülasyonları doğası farklıdır. Cytobrushes CD14 + monositler / makrofajlar 13 daha yüksek bir oranda bir araya gelmesinden ise Biyopsiler, CD3 + T hücrelerinin daha yüksek bir oran toplamak.
FGT immünolojisini incelenmesi uzun yıllar 20-22 bir ilgi oldu ve biz cytobrush türetilmiş CMC çalışma ile uzmanlık büyük bir birikimi var. Bizim çalışmalar, HIV ile enfekte enfekte ve HIV-seronegatif maruz Nairobi, Kenya (HESN) kadın seks işçileri çalışma çoğunlukla odaklanmak. HIV tercihli olarak FGT HIV tarafından hedeflenebilir aktive edilmiş hücre 23 ve daha düşük sayılar HIV satın karşı korunmasına katkıda bulunabilir, aktive edilmiş T hücrelerinde çoğaltır. Bu hipoteze göre, birkaç Studi doğrultusundaes henüz 24,25 enfekte kalır ve bu hareketsiz fenotip de FGT 14 gözlenen yüksek HIV maruz HESN seks işçileri arasında düşük bağışıklık aktivasyonunu tarif var. Burada, işleme için bir yöntem tarif ve ex vivo akış sitometrisi ile servikal cytobrushes türetilen CMC örneklerde T hücrelerinin aktivasyonunun değerlendirilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kadın genital sistem (FGT) de dokunulmazlık ile ilgili bilgide büyük boşluklar göz önüne alındığında, CMC fenotipik analizi serviks birden fazla lenfosit nüfus içine anlayışlar geniş bir dizi sağlayabilir. Proteomik analizi ve servikal lavajında viral yük ölçümleri ile birleştiğinde, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar (CYBE) ler ve diğer patojenler için bağışıklık çeşitli toplumlarda disseke edilebilir.
Teknik hususlar – CMCs: izolasy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- . UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
