Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Summary

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Abstract

È diventato sempre più evidente che la distribuzione spaziale e il moto dei componenti della membrana, come i lipidi e le proteine ​​sono fattori chiave nella regolazione di molte funzioni cellulari. Tuttavia, a causa della dinamica veloci e le minuscole strutture coinvolte, risoluzione spazio-temporale molto elevata è necessaria per catturare il reale comportamento delle molecole. Qui vi presentiamo il protocollo sperimentale per lo studio della dinamica delle proteine ​​e dei lipidi plasmatici-membrana fluorescenza marcata nelle cellule vive con alta risoluzione spazio-temporale. In particolare, questo approccio non ha bisogno di tenere traccia di ogni molecola, ma calcola comportamento popolazione utilizzando tutte le molecole in una regione della membrana. Il punto di partenza è una immagine veloce di una regione determinata sulla membrana. Successivamente, una completa funzione di autocorrelazione spazio-temporale è calcolato correlando immagini acquisite ad aumentare i ritardi, per esempio ogni 2, 3, n ripetizioni. E 'possibile dimostrare che la larghezzadel picco dei spaziali aumenti funzione di autocorrelazione al crescente temporizzazione in funzione del movimento delle particelle a causa della diffusione. Pertanto, il montaggio della serie di funzioni di autocorrelazione consente di estrarre la proteina effettiva media cilindrata piazza da immagini (IMSD), qui presentato in forma di apparente diffusività vs spostamento medio. Questo produce una visione quantitativa della dinamica medi delle singole molecole con precisione nanometrica. Utilizzando una variante GFP-tagged della transferrina recettore (TFR) e un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (PPE) è possibile osservare la regolazione spazio-temporale di proteine ​​e lipidi diffusione su micron-sized regioni membrana nell'intervallo di tempo di micro-to-milli-secondi.

Introduction

Partendo dal modello originale "mosaico fluido" di Singer e Nicolson, l'immagine di membrana plasmatica cellulare è stato costantemente aggiornato nel corso degli ultimi decenni, al fine di comprendere il ruolo emergente del citoscheletro e lipidi domini ^1,2.

Le prime osservazioni sono state ottenute da recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) svelamento che una frazione significativa di proteine ​​di membrana è immobile ^3-5. Questi studi pionieristici, anche se molto informativo, sofferto dalla relativamente scarsa risoluzione spaziale (micron) e di tempo (secondi) di configurazioni FRAP. Inoltre, essendo una misura media insieme, FRAP manca di dare informazioni sul comportamento singola molecola.

In questo contesto, la possibilità di etichettare specificamente una singola molecola di etichetta molto luminosi (permettono lo studio del processo di diffusione una molecola alla volta) ha avuto molto successo. In particolare, spingendo l'risoluzione temporale dell'approccio singola particella di monitoraggio (SPT) per i tempi microsecondi, Kusumi, et al. accesso maturata alle funzioni sconosciute della dinamica dei lipidi e delle proteine ​​che grandemente contribuito al riconoscimento del ruolo di base di actina-membrana scheletro in membrana fisiologia ^{6 , 7.} Questi risultati hanno generato il così chiamato il 'picchetto recinto e' il modello, in cui lipidi e proteine ​​diffusione è regolata da scheletro a base actina-. Tuttavia, al fine di avere accesso alla enorme quantità di informazioni fornite da SPT molte questioni sperimentali devono essere affrontate. In particolare, la procedura di etichettatura è tipicamente composta da molte fasi come la produzione, la purificazione e l'introduzione di specie marcate nel sistema. Inoltre, le grandi etichette, come punti quantici o nanoparticelle metalliche, sono spesso necessari per raggiungere la scala cronologica inferiore al millisecondo e la reticolazione delle molecole bersaglio per l'etichetta non poteva essere evitato in molti casi. Infine, molte traiettoriedevono essere registrati per adattarsi criteri statistici e contemporaneamente è richiesta una bassa densità dell'etichetta per consentire il monitoraggio.

Rispetto a SPT, spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS), superando molti di questi inconvenienti, rappresenta un approccio molto promettente per studiare la dinamica molecolare. In realtà, FCS funziona bene anche con le etichette dim e densi, consentendo di studiare la dinamica di molecole proteiche-tag fluorescenti nelle cellule trasfettate. Inoltre, permette di raggiungere elevate statistiche in un periodo di tempo limitato. Infine, nonostante la densità "alta" delle etichette FCS fornisce informazioni di singole molecole. Grazie a tutte queste proprietà, FCS rappresenta un approccio molto semplice ed è stato ampiamente applicato a studiare la dinamica dei lipidi e proteine ​​sia in membrane modello e in vivo cellule ^8-10. Molti approcci diversi sono stati proposti per aumentare la capacità di FCS per rivelare i dettagli di diffusione molecolare. Per esempio, è stato shproprio che eseguendo FCS sulle aree di osservazione di diverse dimensioni si può definire un "diritto FCS diffusione" caratteristiche illuminanti nascosti del moto molecolare ^11,12. Oltre ad essere variato in termini di dimensioni, l'area focale è stato ripetuto anche ^{il 13,} si trasferisce in uno spazio lungo le linee ^14-20 o coniugati con telecamere veloci ^21,22. L'utilizzo di questi correlazione 'spazio-temporale' approcci, parametri biologici rilevanti dei diversi componenti di membrana sono stati quantitativamente descritti su entrambe le membrane modello e quelle biologiche attuali, quindi visione cedimento in membrana organizzazione spaziale.

Tuttavia, in tutti gli FRAP e applicazioni FCS descritto finora la dimensione della zona focale rappresenta un limite di risoluzione spaziale che non può essere superata. Diversi metodi di imaging super-risoluzione sono state recentemente sviluppate per aggirare questo limite. Alcuni sono basati sulla precisione di localizzazione, come ad esempio stocastico la microscopia ottica ricostruzione (STORM) <sup> 23,24, la microscopia localizzazione fotoattivazione (PALM) ^25, fluorescenza PALM (FPALM) ^26, e single-particelle di tracking PALM (sptPALM) ^27: relativamente grande quantità di fotoni necessari ad ogni snapshot, tuttavia, limita la risoluzione temporale di questi metodi per almeno diversi millisecondi, ostacolando così la loro applicabilità in vivo.

Al contrario, una promettente alternativa per Super Resolution Imaging sono stati aperti dal spazialmente modulando l'emissione di fluorescenza con i metodi di deplezione emissione stimolata (STED o reversibili saturabili transizioni ottiche di fluorescenza (RESOLFT)) ^28,29. Questi approcci combinano la sagomatura del volume osservazione ben al di sotto del limite di diffrazione con la possibilità di utilizzare microscopi a scansione veloce e sistemi di rilevazione. In combinazione con l'analisi di fluorescenza fluttuazione, microscopia STED permesso di sondare direttamente le dinamiche spazio-temporali nanoscala di lipidi e proteins in membrane cellulari dal vivo ^30,31.

Le stesse grandezze fisiche di microscopia basata STED possono essere ottenuti da un spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale modificato (STICS ^32,33) metodo che è adatto per lo studio della dinamica delle proteine ​​fluorescenti-taggato membrana e / o lipidi in cellule vive e da un microscopio commerciale. Il protocollo sperimentale qui presentata è composta da pochi passi. Il primo richiede l'imaging veloce della regione di interesse sulla membrana. Poi, la pila risultante di immagini viene utilizzato per calcolare le funzioni di correlazione medi spazio-temporali. Con il montaggio della serie di funzioni di correlazione, la 'legge di diffusione' molecolare può essere ottenuto direttamente dalle immagini sotto forma di una diffusività apparente (D _app) – vs medi di equipaggio grafico di spostamento. Questa trama dipende in modo critico l'ambiente esplorato dalle molecole e permette di riconoscere direttamente le modalità di diffusione attualidel lipide / proteina di interesse.

In più particolari, come precedentemente indicato ^34, la funzione di autocorrelazione spazio-temporale della serie dell'immagine acquisita dipende in modo critico dalla dinamica delle molecole si muovono nella serie di immagini raccolte (si ricorda che lo stesso ragionamento può essere applicato in una linea di acquisizione dove solo una dimensione nello spazio è considerato). In particolare, si definisce la funzione di correlazione come:

(1)

dove rappresenta l'intensità di fluorescenza misurata nella posizione x, y, al tempo t, e rappresenta la distanza in x eindicazioni y rispettivamente, rappresenta l'intervallo di tempo, e rappresenta la media. Questa funzione può essere espressa come:

(2)

dove 'N' rappresenta il numero medio di molecole nella zona di osservazione, rappresenta l'operazione di convoluzione nello spazio, e rappresenta l'autocorrelazione della vita strumentale. Quest'ultimo può essere interpretato come una misura di quanto i fotoni di un singolo emettitore sono sparsi nello spazio a causa della configurazione ottica / registrazione (la cosiddetta Point Spread Function, PSF, geneRALLY ben approssimata da una funzione gaussiana). Infine, rappresenta la probabilità di trovare una particella a distanza e dopo un ritardo . Se consideriamo una dinamica diffusiva, in cui le particelle si muovono in modo casuale in tutte le direzioni e flussi netti non sono presenti, questa funzione è anche ben approssimata da una funzione gaussiana dove la varianza può essere identificato come il Mean Square Displacement (MSD) della particella in movimento . Così, la vita della funzione di correlazione (indicato anche come ), Può essere definito come la somma dei DMS particelle e la vita strumentale e può essere misurata con una misura gaussianazione della funzione di correlazione per ogni ritardo. La misurato i MSD può essere usato per calcolare un diffusività apparente delle molecole in movimento e uno spostamento medio come:

(3)

(4)

Poche considerazioni sul setup sperimentale utilizzato può guidare il lettore attraverso i seguenti sezioni. Al fine di eccitare selettivamente i fluorofori sulla membrana basale delle cellule useremo una riflessione interna (TIR) ​​illuminazione totale vivente, utilizzando una fluorescenza TIR commerciale (TIRF) microscopio (i dettagli si possono trovare nella sezione materiali). Inoltre, al fine di raccogliere the fluorescenza useremo un obiettivo ad alto ingrandimento (100X NA 1,47, alta apertura numerica è necessaria per l'illuminazione TIRF) e una fotocamera EMCCD (dimensione fisica del pixel sul chip 16 micron). Per raggiungere una dimensione di pixel di 100 nm applichiamo una lente di ingrandimento supplementare di 1.6X. Come discusso in seguito, una risoluzione temporale inferiore a 1 msec sarebbe necessario per descrivere correttamente le dinamiche di lipidi di membrana veloci sotto i 100 nm. Per raggiungere questa risoluzione temporale dobbiamo selezionare una regione di interesse (ROI) più piccolo dell'intero circuito integrato della fotocamera (512 x 512). In questo modo, la fotocamera leggerà un numero ridotto di linee aumentando la risoluzione temporale. Tuttavia, in questo regime lettura il lasso di tempo sarebbe limitata dal tempo necessario per spostare le cariche dalla esposizione al chip di lettura sulla fotocamera e di solito dell'ordine di millisecondi per 512 x 512 pixel EMCCD. Per battere questo limite, una tecnologia emergente consente di spostare le ROI linee solo che invece di tutta la struttura, won una riduzione effettiva pratica della dimensione del chip esposto (chiamata modalità ritagliata sensore nel nostro EMCCD). Per questa configurazione sia efficace, il chip di fuori della ROI deve essere coperta da una coppia di feritoie montati nel percorso ottico. Grazie a questa configurazione di risoluzione tempo fino a 10 ^-4 secondi può essere raggiunto. Si prega di notare, tuttavia, che questo approccio può essere accoppiato con molte diverse configurazioni sperimentali, come spiegato nella sezione 'discussione'.

Dimostrazione del metodo sarà fornito in cellule vive, utilizzando sia un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) e una variante di GFP-etichetta della transferrina recettore (GFP TFR). Nel caso di ATTO488-PPE questo approccio può recuperare correttamente _{un'applicazione} D pressoché costante in funzione di spostamento medio indica una diffusione prevalentemente libera, come precedentemente riportato ^30,35. Al contrario, TFR-GFP mostra una diminuzione D <sub> app in funzione della cilindrata media, suggerendo diffusione parzialmente confinata ^6. Inoltre, in quest'ultimo caso è possibile quantificare la costante diffusione locale e la superficie media di confinamento di numerose micron sul piano membrana.

Protocol

Calibrazione 1 Sistema Point Spread Function (PSF) calibrazione Diluire 10 ml di soluzione di 30 nm perline fluorescenti (circa 5 mM) in 90 ml di acqua distillata e poi sonicare la soluzione per 20 min. Tagliare un quadrato (1 cm x 1 cm) pezzo di gel di agarosio (3%) e deposito 10 microlitri della soluzione sulla superficie del gel. Capovolgere il pezzo di gel sul vetro fondo di un piatto 2 centimetri Petri e spremere la goccia sul vetro. Accendere il setup di acquisizione, mettere il campi…

Representative Results

Per calibrare la vita strumentale, l'immagine di una singola fluorescente nano-tallone può essere misura come descritto nel protocollo punto 1.1. Una tipica immagine fluorescente di queste perle è presentato in Figura 1. Il montaggio della distribuzione dell'intensità da una funzione gaussiana 2D restituisce buoni residui e permette che misura la vita strumentale a 270 nm. Questo valore è in buon accordo con il limite di diffrazione atteso stimato con l'equazione di Rayleigh. Questa tara…

Discussion

Tracciamento singola particella (SPT) rappresenta una delle strategie più comuni per lo studio della dinamica molecolare e ha il grande vantaggio di misurare traiettorie delle particelle. Questo a sua volta permette di sondare il comportamento anche di poche particelle etichettati in un sistema complesso. Tuttavia, per raggiungere questo vantaggio SPT bisogno tipicamente una bassa densità della sonda ed etichette molto luminosi. In particolare, per ottenere l'alta risoluzione temporale (intervallo msec) sonda inor…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
iXon Ultra 897	Andor	DU-897U-CS0
Solis	Andor
CHO-K1	ATCC	CCL-61
ATTO 488 labeled PPE	ATTO-TEC GmbH	AD 488-151
DOPE	Avanti Polar Lipids, Inc.	850725
DOTAP	Avanti Polar Lipids, Inc.	890890
100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Gibco	10378-016
DMEM/F-12	Gibco	21331
FBS	Gibco	10082147
HEPES	Gibco	15630-106
PBS	Gibco	10010-023
SimFCS 3.0	Globals Software		the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 with TIRF modulus	Leica
LAS AF	Leica
Lipofectamine 2000	Lipofectamine	11668019
Matlab	MathWork
Imagej	NIH
C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor	OriGene	RG200980
Agar	Sigma Aldrich	A5306
Chloroform	Sigma Aldrich	528730
Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm	Sigma Aldrich	L5155
SONICA Ultrasonic Cleaners	SOLTEC	ETH S3
Petri Dishes	Willco	GWSt-3522
Bio-Format importer for Matlab			http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
ICS-MatLab Tools			https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip
Simulation by Matlab Tutorial			https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
Simulation by SimFCS Tutorial			https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt