Summary
巢蛋白表达祖细胞是在发展中国家小脑的神经元祖细胞的新发现的种群。用在这里用荧光激活细胞分选组合呈现的显微切割技术中，该细胞群可与任何其他小脑区域污染被纯化和可以培养用于进一步研究。
Abstract
显微切割是一种新技术，可以分离组织的特定区域，消除污染邻近地区的细胞来源。在这项研究是第一个使用这种方法巢蛋白表达祖商（NEP），细胞在小脑外部生发层（EGL）的新发现的种群。在组合使用显微切割用荧光激活细胞分选（FACS），棉结的纯群体是从在EGL常规颗粒神经元前体和从其它污染巢蛋白表达细胞在小脑分开收集。未经显微切割，棉结的功能分析将不会有可能与可用的电流的方法，如Percoll密度梯度离心法和激光捕获显微解剖。该技术还可以应用于用于与包含任一可识别的区域或荧光标记细胞的各种组织中的使用。最重要的是，这主要microdissectio优势Ñ技术是分离的细胞是活的，并且可以被培养了进一步的实验，这是目前不可能与其他所描述的方法。
Introduction
小脑由多个细胞层，每层含有不同的细胞类型。在开发过程中，东瀛包含增殖颗粒神经元前体（国民生产总值），而分子层和浦肯野层包含伯格曼胶质细胞和浦肯野神经元，分别。小脑深处位于脑白质，其中包含神经干细胞（NSCs）和少突胶质细胞1。
音猬蛋白（Shh的）在调节小脑发育的关键作用，特别是，它促进的GNP的增殖通过与其受体结合补丁（PTC），对Shh信号2-4的负调节物。的Shh信号传导的异常活化产生髓母细胞瘤（MB），在孩子5,6中最常见的恶性脑肿瘤。
PTC突变MB的转基因小鼠模型是MB的学习功能强大的工具，开发肿瘤类似人类MB 7,8。使用这些小鼠，它被发现的GNP是起源于刺猬型MB 7的细胞。此外，除的GNP，我们最近发现的显影小脑也可以产生MB的EGL内的神经元祖细胞的独特群体。这些细胞表达高水平的VI型中间丝蛋白，巢蛋白，并且被称为网络设备供应商9。的NEP位于EGL的深部内并仅在新生儿小脑发育存在短暂。他们致力于颗粒细胞系作为国民生产总值却是不同的，因为它们是静态和不表达MATH1，一个完善的标志传统国民生产总值10。此外，网络设备供应商产生MB比更有效地活化Shh信号通路9，这使得它们的新型原点为MB的肿瘤发生后的GNP。
我们以前的显微切割技术分离出小脑东瀛非符合资格人士在4（P4）日龄这里说明9。通过组织直接镜检可视显微允许小脑东瀛的具体解剖。这是必要的，因为巢是由神经干细胞在小脑白质和伯格曼胶质细胞中的分子层1,7,11,12也表示，这是至关重要的，这些细胞不被包括在内，因为他们混淆分析。细胞显微组织分离可立即用于分子分析，或者它们可以被培养用于进一步的应用。
为了有助于具体microdissecting的EGL和进一步纯化的NEP，MATH1-GFP（绿色荧光蛋白）的小鼠进行杂交以巢蛋白-CFP（青色荧光蛋白）的小鼠。转录因子MATH1通过的GNP和GFP表达特异性表达是在EGL 9,13清晰可见。 巢蛋白-CFP小鼠表达CFP的核形式，并且可以很容易地可视化的分子层9,14。总之，GFP和CFP的表达创造边界东瀛的显微切割（ 见图1）。 CFP-阳性的NEP，然后通过FACS分离，继解剖EGLS的酶解。
目前，使用最多的方法也从东瀛分离细胞是整个小脑组织15,16 Percoll密度梯度离心法。这个方法，但是，不能完全排除从分子层和白质巢蛋白+细胞群中，因此不能被用于网络设备供应商的研究。激光捕获显微切割，其使用激光能量的传递，以除去所关注的细胞，是一种用于多相组织17,18内分离特定的细胞，但捕获的细胞仅可用于DNA，RNA和蛋白质的回收和不是另一种方法能够进行培养。
该协议提供了一种专门隔离东瀛非符合资格人士的活着，纯粹的人口。这种技术也可以应用于具有任何可识别的解剖结构或荧光标记细胞/区域不同的组织类型。因此，将这一新颖显微切割技术进入细胞的分离协议的主要优点是，细胞可以从特定组织区域进行分离，以消除污染邻近的组织和细胞可以立即被收集用于分析或培养的其他应用程序。
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Protocol
已按照批准的Fox Chase癌症中心的动物护理和使用委员会的程序在执行该协议利用动物。
1，准备工具，解决方案和盖玻片
- 清洁两套＃5细镊子，一组7号细弯钳，一个大的手术剪刀，1 microdissecting剪一小铲和一个带孔的勺子。将仪器的自密封消毒袋和高压锅。请眼袋仪器，直到准备使用。
- 制备3％低熔点琼脂糖溶液。
- 添加1.5克琼脂糖至50毫升无菌贝科的磷酸盐缓冲液（DPBS）中，然后放入微波炉，加热至泡沫出现。漩涡烧瓶中，并再加热，直到所有的琼脂糖溶解。混合与搅拌棒的解决方案之前，如果加热团块出现。
- 在37℃水浴商店解决方案，直到需要。
- 对于长期存储媒体E，存储以供将来使用的琼脂糖溶液，在室温或4℃下进行几个月。再热的微波液化。在琼脂糖溶液中反复加热，加热以保持其与温暖无菌蒸馏水初始重量之前称量烧瓶中。
- 准备如前所述2木瓜蛋白酶类细胞分离通过以下方法解决：
- 木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶（100单位/毫升），半胱氨酸（0.2毫克/毫升）和DNA酶（250 U / ml）的无菌酚红含-DPBS。
- 在无菌的无酚红的含DPBS，大豆胰蛋白酶抑制剂（8毫克/毫升））和DNA酶（250单位/毫升），用牛血清白蛋白的卵类粘蛋白溶液（8毫克/毫升BSA）。
过滤消毒，这两种解决方案，并调节pH值，返回酚红含的DPBS原来的颜色。
- 制备的细胞培养基（NB / B27）：补充基础培养基用1mM丙酮酸钠，2mM的L-谷氨酰胺，1％青霉素 - 链霉素（P / S）和B27补充剂。滤清器ř消毒和避光。在使用前平衡在37℃的介质和5％的CO 2。
- 制备FACS缓冲液：5％的胎牛血清（FBS）的DPBS中。添加2.5毫升胎牛血清47.5毫升DPBS。
- 制备聚-D-赖氨酸（PDL）包被的盖玻片上。
- 新高压灭菌盖玻片。
- 外套与PDL中的盖玻片（在无菌蒸馏水中100微克/毫升）并孵育2小时，在37℃或室温下放置过夜。
- 洗涤盖玻片，用无菌蒸馏水。采用NB / B27传媒洗一次。让盖玻片在使用前组织培养罩完全干燥。
2，解剖组织切片和准备
- 上解剖当天，擦拭用70％乙醇和盖的吸水垫的解剖区域。
- 从灭菌袋中取出解剖工具。添加冰冷，无菌DPBS / 1％P / S的小培养皿，置于冰上。
- 杀头的P4 MATH1-GFP / 巢蛋白CFP小鼠的幼崽有大的手术剪刀然后按住低着头用细弯钳。取出皮肤，轻轻剥离用＃5的头骨从头骨使用刮刀细钳子然后舀出脑，并将其转移至含有DPBS / 1％P / S的培养皿中。
- 使用5号细镊子，小心地从大脑的其余部分分离小脑。一定要尽快解剖1小狗在同一时间成为可能。
- 收集至少8小脑，以获得足够的非符合资格人士的分子和功能分析。
- 填充嵌入模具测量2×2×2厘米，3％低熔点琼脂糖溶液。确保琼脂糖的温度不超过37℃。
- 通过在实验室组织轻轻涂抹去除小脑多余的液体。将小脑成模在垂直位置。放置在冰上的模具以允许其快速固化。使用每块〜4小脑。
- 获得李咏组织切片用振动叶片vibratome。修剪含小脑，用刀片琼脂糖块。胶琼脂糖块到vibratome板与小脑定向在垂直位置。
- 填补vibratome的用冰冷却的无菌DPBS / 1％P / S和地方冰下方的托盘上。
- 切成600微米的部分通过小脑的整个长度。收集使用穿孔勺子从冰盘的部分。地方的部分在培养皿中填充用DPBS / 1％P / S在冰上。
3，显微切割和细胞分离
- 将含有荧光解剖显微镜下组织切片的培养皿中。
- 小心地用细镊子小脑节的其余部分由CFP +分子层和GFP +东瀛之间的夹层中（参见虚线图1）分离东瀛。小心不包括任何部分的分子层的，这将导致在污染的巢蛋白表达伯格曼胶质细胞。
- 尽可能快地完成这个步骤，并保持组织在冰上，以避免细胞死亡。
- 在进行下一步骤之前，除去周围的组织的琼脂糖。
- 消化使用如前所述2，得到单细胞悬浮液中的木瓜蛋白酶的基于协议的显微EGL组织。
- 重悬的细胞在FACS缓冲液用于收集通过FACS CFP-阳性细胞。
4，细胞分选及镀层
- 使用无菌，高速流式细胞仪包含适当的CFP过滤器和收集细胞，流式细胞仪缓冲冰上排序细胞CFP荧光。获得每个P4小脑大约100,000非符合资格人士。
- 离心细胞，在300×g离心5分钟。立即进行分子分析，或文化进行进一步的实验用的细胞。
- 向培养的细胞，重新悬浮细胞在预热NB / B27米EDIA和盘上的PDL涂覆的盖玻片如前所述2。
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Representative Results
如图1A所示 ，小脑切片从P4 MATH1-GFP / 巢蛋白-CFP小鼠制备的，其中，所述小脑EGL主要是由绿色荧光蛋白表达的GNP和分子层中富集由CFP-阳性的神经胶质细胞。 （; 图1A中沿虚线）以分离的NEP位于EGL的深部的，切片的EGL和分子层之间的微切割。剖分EGLS（ 图1B）然后收集用酶解随后通过FACS。
正如预期的那样，细胞在解剖东瀛的大部分（超过85％）是传统的国民生产总值，这是积极的GFP（ 图2A）。非符合资格人士（CFP +）只占5％左右的东瀛细胞群。几乎基于FACS分析无的细胞是双阳性的GFP和CFP。通过FACS纯化的CFP +细胞，进行体外培养，研究分化POTE微分方程边值问题的。 如图2B所示 ，网络设备供应商只产生了β-微管蛋白阳性神经元在培养4天后，暗示的NEP是谱系限制性神经元前体细胞。
通过这种显微协议，网络设备提供商和国民生产总值也来自东瀛的PTC不足的小脑纯化。在颅内移植，棉结开发的MB更迅速与的GNP相比，表明的NEP特别容易致癌性转化9。
图1标识该地区的东瀛显微切割，荧光图像从P4 MATH1-GFP /巢蛋白CFP动物（A）GFP表达坐落于东瀛，而大多数CFP表达的是位于分子层。显微切割沿吨做他黄色虚线（B）EGLS共收集组织离解。这个数字已经被修改Li 等[9]。
图2：网络设备供应商代表一小群细胞在东瀛，并谱系限制性神经前体细胞。 （A）流式细胞术CFP +细胞的显微EGL分离的分析（B）的NEP被分化的条件下培养4天，并染为β-微管蛋白（红色）和counterstained用DAPI（蓝色）。这一数字已经从李等人9
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Discussion
此处所描述的显微切割的方法是能够分离的活细胞中的分子和功能分析使用的纯群体的第一个过程。这表现在Li 等人9， 通过该方法得到的NEP可以培养并掺入了各种实验，并由于其高纯度的，也可用于微阵列分析。
花时间去精通这种显微切割技术，这是非常重要的。的NEP位于EGL的深区域中的非常接近的分子层，其中巢蛋白表达伯格曼胶质细胞可能污染NEP细胞的分离和妥协纯度。显微切割，因此应做得保守，以确保污染细胞在相邻的组织不包括在内。此处所描述的显微切割技术的主要优点是能够获得活细胞的能力，可培养对furtheŘ实验。由于这个原因，至关重要的是，在此过程中的所有步骤可以快速地完成，该组织被保持在冰上尽可能。此外，所有的仪器和试剂必须是无菌的。以下这些步骤将减少细胞死亡和细胞培养的污染。此外，每琼脂糖块安装多个小脑将有助于减少手术时间。
本技术不限于棉结的隔离，并且可以被用来收集来自小脑的其他领域，例如从白质分子层和神经干细胞的神经胶质细胞的细胞。旁边的小脑，显微切割可用于与包含可识别的区域，如海马，例如其他组织。使用荧光转基因的，如利用这里，可以在创建边界帮助或确定区域的夹层，其可以是在缺乏容易识别的区域的组织特别有用并且否则不能够是米icrodissected。因此，该技术可以帮助细胞纯化的广泛的研究领域和应用。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢詹姆斯Oesterling流式细胞仪的帮助。这项研究是由美国国家癌症研究所（R01-CA178380，ZY）和美国国家研究院博士后培训补助（5T32CA009035-37，LWY）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
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