Summary
progéniteurs exprimant la nestine sont une population nouvellement identifié des progéniteurs neuronaux dans le cervelet en développement. En utilisant la technique de microdissection présentés ici, en combinaison avec un tri cellulaire activé par fluorescence, cette population cellulaire peut être purifié sans contamination par d'autres régions du cervelet et peut être mis en culture pour des études ultérieures.
Abstract
Microdissection est une nouvelle technique qui peut isoler des régions spécifiques d'un tissu et d'éliminer la contamination à partir de sources cellulaires dans les zones adjacentes. Cette méthode a été utilisée la première fois dans l'étude de progéniteurs exprimant la nestine (PES), une population de cellules nouvellement identifié dans la couche externe du cervelet germinal (EGL). Utilisation de microdissection en combinaison avec un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), une population pure de PES a été collecté séparément de précurseurs neuronaux granulés classiques de l'EGL et d'autres cellules exprimant la nestine-contaminantes dans le cervelet. Sans microdissection, des analyses fonctionnelles de PES n'auraient pas été possible avec les méthodes actuellement disponibles, tels que gradient de Percoll centrifugation et microdissection laser. Cette technique peut également être appliquée pour une utilisation avec divers tissus qui contiennent des régions reconnaissables ou des cellules marquées par fluorescence. Plus important encore, un avantage majeur de cette microdissection technique est que les cellules isolées vivent et peuvent être cultivées pour plus d'expérimentation, qui n'est actuellement pas possible avec d'autres méthodes décrites.
Introduction
Le cervelet est constitué de plusieurs couches de cellules, chacune contenant des types cellulaires distincts. Au cours du développement, la prolifération des précurseurs EGL contient des granules de neurones (PNB), tandis que la couche moléculaire et la couche de Purkinje contiennent neurones Bergmann gliales et de Purkinje, respectivement. Profondément dans le cervelet se trouve la substance blanche, qui contient des cellules souches neurales (NSC) et les oligodendrocytes 1.
Sonic hedgehog (Shh) joue un rôle essentiel dans la régulation du développement du cervelet et en particulier, il favorise la prolifération des PNB par liaison à son récepteur Patched (Ptc), un régulateur négatif de la signalisation de Shh 2-4. Activation aberrante de signalisation de Shh génère médulloblastome (MB), la tumeur la plus fréquente de cerveau maligne chez les enfants 5,6.
Modèles de souris transgéniques Ptc de MB mutants sont des outils puissants pour l'étude de la MB et développent des tumeurs ressemblant MB humaine 7,8. L'utilisation de cessouris, on a découvert que le PNB sont la cellule d'origine pour hérisson de type MB 7. En outre, en plus de PNB, nous avons récemment identifié une population unique de progéniteurs neuronaux au sein de l'EGL du cervelet développement qui peut également donner lieu à MB. Ces cellules expriment des niveaux élevés de la protéine de type VI de filament intermédiaire, la nestine, et sont appelés PES 9. PES sont situés dans la partie profonde de la EGL et existent de façon transitoire seulement au cours du développement du cervelet néonatale. Ils se sont engagés à la lignée de cellules granulaires comme le PNB, mais sont distincts car ils sont au repos et n'expriment pas Math1, un marqueur bien établi de PNB classiques 10. En outre, les PES donnent lieu à MB plus efficacement que le PNB après l'activation de la voie de signalisation de Shh 9, qui en fait un roman pour origine MB tumorigenèse fait.
Nous avons déjà isolé PES de l'EGL cérébelleuse à jour postnatal 4 (P4) par la technique de microdissectiondécrit ici 9. Microdissection par visualisation microscopique direct du tissu permet de dissection spécifique de l'EGL cérébelleuse. Cela est nécessaire car Nestin est également exprimé par les CNS dans la substance blanche du cervelet et par Bergmann cellules gliales dans la couche moléculaire 1,7,11,12 et il est essentiel que ces cellules ne sont pas inclus, car ils confondent l'analyse. Des cellules isolées à partir de tissu microdissection peuvent être utilisés immédiatement pour l'analyse moléculaire ou ils peuvent être cultivés pour d'autres applications.
Pour aider à microdissecting spécifiquement l'EGL et pour purifier davantage les PES, les souris Math1-GFP (protéine fluorescente verte) ont été croisées avec des souris Nestin-CFP (cyan fluorescent protein). Le facteur de transcription Math1 est spécifiquement exprimée par le PNB et l'expression de la GFP est clairement visible dans le EGL 9,13. Souris Nestin-PCP expriment une forme nucléaire de la PCP et peuvent être facilement visualisées dans la couche moléculaire 9,14. Ensemble, GFP et l'expression de la PCP créent des frontières pour microdissection de la EGL (voir Figure 1). PES CFP-positifs ont ensuite été isolées par FACS, après la dissociation enzymatique des RAT disséqués.
Actuellement, la méthode la plus utilisée à bon escient pour isoler les cellules de l'EGL est gradient de Percoll centrifugation du tissu cérébelleux ensemble 15,16. Cette méthode, cependant, ne peut pas exclure totalement populations de cellules nestine + de la couche moléculaire et la substance blanche et ne peut donc pas être utilisé pour l'étude de la PNI. Microdissection par capture laser, qui utilise le transfert d'énergie laser pour retirer les cellules d'intérêt, est un autre procédé utilisé pour isoler des cellules spécifiques au sein d'un tissu hétérogène 17,18 cellules capturées mais ne peuvent être utilisés pour la récupération de l'ADN, de l'ARN et de la protéine et ne sont pas pouvoir être cultivées.
Ce protocole fournit un moyen d'isoler spécifiquement, une population pure vie des PES de l'EGL.Cette technique peut également être appliquée à différents types de tissus qui ont soit l'architecture reconnaissable anatomique ou marquées par fluorescence de cellules / régions. Par conséquent, le principal avantage de l'intégration de cette nouvelle technique de microdissection dans les protocoles d'isolement des cellules est que les cellules peuvent être isolées à partir de régions spécifiques du tissu pour éliminer les tissus voisins et de contaminer les cellules peuvent être recueillies immédiatement pour l'analyse en culture ou pour d'autres applications.
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Protocol
L'utilisation des animaux dans ce protocole a été effectué conformément aux procédures approuvées par le Comité Cancer Center soin et l'utilisation des animaux Fox Chase.
1 Préparation des instruments, des solutions et Lamelles
- Nettoyer les deux ensembles de # 5 pinces fines, un ensemble de n ° 7 pince fine courbes, une grande ciseaux chirurgicaux, un ciseau de microdissecting, un spatule et une cuillère perforée. Placer les instruments dans une poche et autoclave de stérilisation auto-obturant. Gardez instruments de poche jusqu'au moment de son utilisation.
- Préparer une solution à 3% d'agarose à basse température de fusion.
- Ajouter 1,5 g d'agarose dans 50 ml de solution tampon phosphate stérile de Dulbecco (DPBS), puis placer au micro-ondes et de la chaleur jusqu'à ce que des bulles apparaissent. ballon de tourbillon et réchauffer jusqu'à ce que tous agarose a dissous. Mélanger la solution avec une barre d'agitation avant le chauffage si touffes apparaissent.
- Conserver la solution dans un bain-marie à 37 ° jusqu'à ce que nécessaire.
- Pour boît à long termee, stocker la solution d'agarose pour une utilisation ultérieure à la température ambiante ou à 4 ° C pendant plusieurs mois. Réchauffer au micro-ondes pour liquéfier. Pour le chauffage répété de la solution d'agarose, peser le ballon avant de chauffer pour maintenir son poids initial avec de l'eau distillée stérile chaud.
- Préparer les solutions suivantes pour la dissociation des cellules sur la base de la papaïne-2 tel que décrit précédemment:
- Une solution de papaïne à la papaïne (100 U / ml), la cystéine (0,2 mg / ml) et de la DNase (250 U / ml) dans du phénol rouge stérile contenant du DPBS.
- Une solution ovomucoïde avec de l'albumine de sérum bovin (BSA; 8 mg / ml), un inhibiteur de la trypsine du soja (8 mg / ml)) et de la DNase (250 U / ml) dans du phénol rouge stérile contenant du DPBS.
Stériliser par filtration des solutions et ajuster le pH à retourner couleur d'origine du rouge de phénol contenant DPBS.
- Préparer des milieux de culture cellulaire (NB / B27): compléter milieux de base avec 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) et un supplément B27. Filter stériliser et protéger de la lumière. Equilibrer support à 37 ° C et 5% de CO 2 avant l'utilisation.
- Préparer le tampon FACS: 5% de sérum bovin fœtal (FBS) dans du DPBS. Ajouter 2,5 ml de FBS à 47,5 ml DPBS.
- Préparation de poly-D-lysine (PDL) des lamelles revêtues d'.
- Autoclave nouvelles lamelles de verre.
- Enduire les lamelles avec PDL (100 ug / ml dans de l'eau distillée stérile) et incuber pendant 2 heures à 37 ° C ou à température ambiante jusqu'au lendemain.
- Laver lamelles de d'eau distillée stérile. Laver une fois avec NB / B27 médias. Laissez sécher complètement lamelles en culture de tissus capot avant de l'utiliser.
2 Dissection et préparation des tranches de tissu
- Le jour de dissection, essuyez la zone de dissection éthanol à 70% et la couverture d'un tampon absorbant.
- Déposer les outils de dissection de la poche de stérilisation. Ajouter glacée, DPBS stériles / 1% P / S à une petite boîte de Petri et placer sur la glace.
- Décapiter P4 Math1-GFSouriceaux P / Nestin-PCP avec de grands ciseaux chirurgicaux détiennent alors la tête vers le bas avec de fines pinces courbes. Enlever la peau et peler doucement le crâne avec # 5 pinces fines puis évider le cerveau du crâne à l'aide d'une spatule et transférer à la boîte de Pétri contenant du DPBS / 1% P / S.
- Utilisation # 5 pinces fines, séparer soigneusement le cervelet du reste du cerveau. Assurez-vous de disséquer un chiot à un moment aussi rapidement que possible.
- Recueillir un minimum de 8 cervelet afin d'obtenir suffisamment de PES pour les analyses moléculaires et fonctionnelles.
- Remplir un moule mesurant l'incorporation de 2 x 2 x 2 cm avec une solution à 3% d'agarose à basse température de fusion. Assurez-vous que la température de l'agarose a pas plus de 37 ° C.
- Retirer l'excès de liquide en tamponnant doucement cervelet sur un tissu de laboratoire. Passer cervelet dans le moule dans une position verticale. Placer le moule dans la glace afin de lui permettre de se solidifier rapidement. Utilisez ~ 4 cervelet par bloc.
- Obtenir licoupes de tissus ving avec un vibratome de lame vibrante. Coupez le bloc d'agarose contenant cerebella-avec une lame de rasoir. Coller le bloc d'agarose à la plaque avec vibratome cervelet orienté dans une position verticale.
- Remplissez le bac de la vibratome avec DPBS glacée stérile / 1% P / S et mettre de la glace en dessous.
- Couper 600 um sections à travers toute la longueur du cervelet. Recueillir sections du plateau de glace à l'aide d'une cuillère perforée. sections de place dans une boîte de Pétri remplie de DPBS / 1% P / S sur la glace.
3. microdissection et Cell Dissociation
- Placez la boîte de Petri contenant des tranches de tissu sous une dissection au microscope à fluorescence.
- Séparez délicatement l'EGL du reste de la section du cervelet en utilisant une pince fine en disséquant entre le PCP couche + moléculaire et la GFP + EGL (voir ligne en pointillés sur la figure 1). Faites attention de ne pas inclure une partie de la couche moléculaire, qui se traduira parcontamination de Nestin exprimant Bergmann cellules gliales.
- Terminez cette étape aussi rapidement que possible et de garder le tissu sur la glace pour éviter la mort cellulaire.
- Retirer le agarose entourant le tissu avant de procéder à l'étape suivante.
- Digérer le tissu EGL microdissection à l'aide d'un protocole à base de papaïne-2 tel que décrit précédemment pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Re-suspendre les cellules dans un tampon FACS pour la collecte de cellules CFP-positifs via FACS.
4. Tri cellulaire et placage
- Trier les cellules de la PCP fluorescence en utilisant un flux à grande vitesse stérile cytomètre contenant un filtre approprié PCP et prélever des cellules dans un tampon FACS sur la glace. Obtenir environ 100.000 PES de chaque cervelet P4.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. Utiliser des cellules immédiatement pour l'analyse moléculaire ou la culture pour de nouvelles expérimentations.
- Pour des cellules en culture, remettre en suspension les cellules dans préchauffé NB / B27 mdias et la plaque sur des lamelles PDL revêtus tels que décrits précédemment 2.
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Representative Results
Comme le montre la figure 1A, tranches de cervelet ont été préparés à partir de / souris Nestin-PCP P4 Math1-GFP, dans lequel le EGL cérébelleux a été dominée par PNB exprimant la GFP et la couche moléculaire a été enrichi par les cellules gliales CFP-positifs. Pour isoler les PES qui sont situés dans la partie profonde de la EGL, tranches ont été microdisséquées entre l'EGL et la couche moléculaire (le long de la ligne pointillée, figure 1A). RAT disséqués (figure 1B) ont ensuite été recueillis pour la dissociation enzymatique suivie par FACS.
Comme prévu, la majorité (plus de 85%) de cellules dans le EGL sont disséqués PNB classiques, qui étaient positives pour la GFP (Figure 2A). PES (PCP +) compte pour environ 5% seulement de la population de cellules EGL. Presque aucun des cellules étaient double-positif pour la GFP et PCP basée sur l'analyse FACS. cellules de la PCP + purifiées par FACS, ont été cultivées in vitro pour examiner le pote de différenciationntial. Comme le montre la figure 2B, PES a exclusivement lieu à β-tubuline + neurones après 4 jours de culture, les PES sont suggérant progéniteurs neuronaux lignée restreinte.
Par ce protocole de microdissection, PES et PNB ont également été purifiés à partir de l'EGL de Ptc cervelet déficient. Après la transplantation intracrânienne, PES développer Mo plus rapidement par rapport aux PNB, ce qui indique que les PES sont particulièrement sensibles à la transformation oncogénique 9.
Figure 1: Identification de la région pour EGL microdissection. Images fluorescentes de P4 Math1-GFP / animaux Nestin-PCP. (A) l'expression de la GFP est situé dans le EGL, alors que la majorité d'expression PCP est situé dans la couche moléculaire. Microdissection a été effectuée le long de til la ligne jaune en pointillés. (B) RAT ont été recueillies pour la dissociation des tissus. Ce chiffre a été modifié depuis Li et al 9.
Figure 2: PES représentent une petite population de cellules dans le EGL et sont progéniteurs neuronaux lignée restreinte. (A) Analyse par cytométrie en flux de la PCP + isolées à partir de cellules microdisséquées EGL (B). PES ont été cultivées dans des conditions de différenciation pendant 4 jours et colorées pour la β-tubuline (rouge) et contre-coloration avec du DAPI (bleu). Ce chiffre a été modifié depuis Li et al. 9
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Discussion
Procédé de microdissection décrite ici est le premier procédé capable d'isoler une population pure de cellules vivantes pour l'utilisation dans des analyses moléculaires et fonctionnels. Comme l'a démontré par Li et al. 9, PES obtenus par ce procédé peuvent être mises en culture et incorporés dans diverses expériences et en raison de leur haut degré de pureté, peuvent également être utilisés pour l'analyse de puces à ADN.
Il est très important de prendre le temps de maîtriser cette technique de microdissection. PES sont situés dans la région profonde de la EGL à proximité immédiate de la couche moléculaire, dans lequel exprimant la nestine Bergmann glie pourrait contaminer l'isolement des cellules NEP et compromettre la pureté. Microdissection doit donc se faire de façon conservatrice pour s'assurer que les cellules contaminantes dans les tissus adjacents ne sont pas inclus. L'avantage majeur de la technique de microdissection décrite ici est la capacité d'obtenir des cellules vivantes qui peuvent être mis en culture pour further expérimentation. Pour cette raison, il est essentiel que toutes les mesures au cours de cette procédure se faire rapidement et que les tissus sont conservés dans la glace autant que possible. En outre, tous les instruments et les réactifs doivent être stériles. Suite à ces mesures permettra de réduire la mort cellulaire et la contamination de culture cellulaire. En outre, le montage cervelet multiple par bloc d'agarose aidera à réduire la durée de l'intervention.
Cette technique n'est pas limitée à l'isolement de PES et peut être utilisé pour recueillir des cellules provenant d'autres zones du cervelet, comme les cellules gliales de la couche moléculaire et les cellules souches neurales de la substance blanche. A côté du cervelet, microdissection peut être utilisé avec d'autres tissus qui contiennent des régions identifiables, telles que l'hippocampe, par exemple. L'utilisation de transgènes fluorescentes, tel qu'il est utilisé ici, peut aider à créer des frontières ou identifier les régions pour la dissection, ce qui peut être particulièrement utile dans les tissus qui n'ont pas les zones facilement identifiables et ne seraient autrement pas en mesure d'être microdissected. Cette technique pourrait donc aider à purifications cellulaires dans un large éventail de domaines de recherche et d'applications.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier James Oesterling pour cytométrie de flux de l'aide. Cette recherche a été financée par une subvention de l'Institut national américain du cancer (R01-CA178380, ZY) et une subvention US National Institutes postdoctorale de formation (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
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