Summary
Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden.
Abstract
Mikrodissektion ist eine neuartige Technik, die spezifische Regionen eines Gewebe zu isolieren und Verunreinigungen zu beseitigen aus zellulären Quellen in benachbarten Bereichen können. Dieses Verfahren wurde in der Studie verwendet Nestin exprimieren Progenitoren (NEP), einem neu identifizierten Population von Zellen in der Klein externe Keimschicht (EGL). Verwendung Mikrodissektion in Kombination mit fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurde eine reine Population Nissen getrennt von herkömmlichen Granulat Neuron Vorstufen in EGL und von anderen kontaminierenden Nestin-exprimierenden Zellen im Kleinhirn gesammelt. Ohne Mikrodissektion würde funktionelle Analysen Nissen nicht mit der aktuellen Methoden zur Verfügung, wie Percoll-Gradienten-Zentrifugation und die Laser Mikrodissektion möglich. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit verschiedenen Geweben, die entweder erkennbar Regionen oder fluoreszenzmarkierten Zellen enthalten eingesetzt werden. Am wichtigsten ist, ein wesentlicher Vorteil dieser microdissection Technik ist, dass isolierte Zellen leben und kann für weitere Experimente, die derzeit mit anderen beschriebenen Methoden nicht möglich ist kultiviert werden.
Introduction
Das Kleinhirn aus mehreren Zellschichten, die jeweils verschiedene Zelltypen umfassen. Während der Entwicklung der EGL enthält wuchernden Granulat Neuron Vorstufen (BSP), während die Molekularschicht und Purkinje-Schicht enthalten Bergmann Gliazellen und Neuronen Purkinje auf. Tief im Kleinhirn liegt die weiße Substanz, die neurale Stammzellen (NSCs) und Oligodendrozyten 1 enthält.
Sonic Hedgehog (Shh) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Kleinhirnentwicklung und insbesondere fördert sie die Verbreitung von BSP über die Bindung an seinen Rezeptor Patched (PTC), einem negativen Regulator der Shh-Signal 2-4. Abweichende Aktivierung des Shh-Signal erzeugt Medulloblastom (MB), der häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern 5,6.
PTC-Mutante MB transgenen Mausmodellen sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung von MB und entwickeln Tumoren menschlichen MB 7,8 ähnelt. Mit diesenMäusen wurde festgestellt, dass BSP sind die Ursprungszelle für Hedgehog-Aktivität MB 7. Ferner, zusätzlich zu BSP, haben wir kürzlich eine einzigartige Population von neuronalen Vorläuferzellen in der EGL des Kleinhirns, die auch die Entwicklung hervorrufen können MB identifiziert. Diese Zellen exprimieren hohe Konzentrationen des Typs VI Intermediärfilament Protein, Nestin, und werden als NEP 9. NEP werden im tiefen Teil der EGL befindet und existieren nur in Neugeborenen vorübergehend Kleinhirnentwicklung. Sie sind auf der Körnerzelllinie als BSP verpflichtet, sondern sind verschieden, wie sie sind und nicht Ruhe Math1, eine gut etablierte Marker für herkömmliche BSP 10 auszudrücken. Darüber hinaus geben Anlass zu NEP MB effizienter als BSP nach Aktivierung des Shh-Signalweg 9, die sie zu einem neuen Ausgangspunkt für MB Tumorentstehung spielt.
Wir haben vorher isoliert NEPs aus der Kleinhirn EGL am postnatalen Tag 4 (P4) durch die Mikrodissektion Technikhier 9 beschrieben. Mikrodissektion über direkte mikroskopische Visualisierung des Gewebes ermöglicht spezifische Präparation der Kleinhirn EGL. Dies ist notwendig, da Nestin auch von NSC in der Klein weißen Substanz und von Bergmann Glia in der Molekularschicht 1,7,11,12 ausgedrückt und es war von entscheidender Bedeutung, dass diese Zellen nicht aufgenommen werden, da sie Analyse verwechseln. Zellen, die aus Gewebe isoliert microdissected kann sofort für die molekulare Analyse verwendet werden, oder sie kann für weitere Anwendungen kultiviert werden.
Auf staatliche Beihilfen, die speziell microdissecting die EGL und zur weiteren Reinigung Nissen, wurden Math1-GFP (green fluorescent protein)-Mäusen mit Nestin-GFP (cyan fluorescent protein)-Mäusen gekreuzt. Der Transkriptionsfaktor Math1 wird speziell durch BSP und GFP-Expression ausgedrückt ist in der EGL 9,13 deutlich sichtbar. Nestin-GFP-Mäuse exprimieren eine Kern Form von GFP und kann leicht in der Molekularschicht 9,14 visualisiert werden. Zusammen, GFP und GFP-Expression zu erstellen Grenzen für die Mikrodissektion der EGL (siehe Abbildung 1). GFP-positiven NEPs wurden dann durch FACS isoliert, nach enzymatischer Spaltung der beschäftigungspolitischen Leitlinien seziert.
Derzeit ist das Verfahren auch verwendet, um Zellen von der EGL isolieren Percoll-Gradienten-Zentrifugation von Vollkleinhirngewebe 15,16. Dieses Verfahren ist jedoch nicht Nestin +-Zellpopulationen aus der Molekularschicht und der weißen Substanz vollständig ausschließen und kann daher nicht für die Untersuchung der NEP verwendet werden. Laser Mikrodissektion, die die Übertragung von Laserenergie verwendet, um Zellen von Interesse zu entfernen, ist eine andere verwendet, um bestimmte Zellen in einer heterogenen Gewebe 17,18 isolieren, sondern gefangenen Zellen können nur zur Gewinnung von DNA, RNA und Protein verwendet werden und sind nicht Verfahren Lage, kultiviert werden.
Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, gezielt isolieren eine lebendige, reine Population Nissen von der EGL.Diese Technik kann auch auf verschiedene Gewebearten, die entweder erkennbar anatomischen Architektur oder fluoreszenzmarkierten Zellen / Regionen angewendet werden. Daher ist der große Vorteil der Einbeziehung dieser neuartigen Mikropräparationsverfahren in Zellisolierungsprotokolle, die Zellen von bestimmten Gewebebereichen getrennt werden, zu beseitigen kontaminierenden benachbarte Gewebe und die Zellen können sofort für eine Analyse oder für andere Anwendungen kultiviert gesammelt werden.
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Protocol
Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Fox Chase Cancer Center Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente, Lösungen und Deckgläser
- Saubere zwei Sätze von # 5 feinen Pinzette, ein Satz von # 7 feinen gebogenen Pinzette, einer großen chirurgischen Schere, eine microdissecting Schere, einem Spachtel und einem Lochlöffel. Legen Sie die Instrumente in einer selbstdichtenden Sterilisationsbeutel und Autoklaven. Halten Sie die Geräte in Beutel bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie eine 3% niedriger Schmelztemperatur Agarose-Lösung.
- 1,5 g Agarose hinzufügen in 50 ml sterilem Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS), dann in der Mikrowelle und Wärme setzen, bis sich Blasen bilden. Swirl Kolben und Zwischenüberhitzung, bis alle Agarose gelöst hat. Mischen Lösung mit einem Rührstab vor dem Erhitzen, wenn Klumpen erscheinen.
- Shop-Lösung in einem 37 ° C warmen Wasserbad, bis sie benötigt.
- Für langfristige storage, speichern die Agarose-Lösung für eine spätere Verwendung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für Monate. Aufwärmen in der Mikrowelle zu verflüssigen. Für wiederholte Erwärmung der Agarose-Lösung, der Kolben wiegen vor dem Erhitzen in seine Ausgangsgewicht mit warmem sterilem destilliertem Wasser zu halten.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Papain-basierte Zell Dissoziation, wie zuvor beschrieben 2:
- Ein Papain-Lösung mit Papain (100 U / ml), Cystein (0,2 mg / ml) und DNase (250 U / ml) in sterilem Phenolrot enthaltende DPBS.
- Eine Ovomucoid-Lösung mit Rinderserumalbumin (BSA, 8 mg / ml), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (8 mg / ml)) und DNase (250 U / ml) in sterilem Phenolrot enthaltende DPBS.
Filter sterilisieren beide Lösungen und pH-Wert auf ursprüngliche Farbe der Phenol-Rot-haltigen DPBS zurückzukehren.
- Vorbereitung Zellkulturmedien (NB / B27): Ergänzung Basalmedium mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) und B27 Supplement. Filter sterilisieren und vor Licht schützen. Äquilibrieren Medien bei 37 ° C und 5% CO 2 vor der Verwendung.
- Vorbereitung FACS-Puffer: 5% fötalem Rinderserum (FBS) in DPBS. Fügen Sie 2,5 ml bis 47,5 ml FBS DPBS.
- Vorbereitung Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Deckgläschen.
- Autoklaven neue Deckgläser.
- Bestreichen Sie die Deckgläser mit PDL (100 ug / ml in sterilem destilliertem Wasser) und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C oder Raumtemperatur über Nacht.
- Waschdeckgläser mit sterilem destilliertem Wasser. Einmal mit NB / B27 Medien waschen. Lassen Deck vollständig trocknen in der Gewebekultur Haube vor der Verwendung.
2. Dissection und Herstellung von Gewebeschnitten
- Am Tag der Präparation, wischen Sie die Dissektion Bereich mit 70% Ethanol und Abdeckung mit einem saugfähigen Unterlage.
- Entfernen Dissektion Werkzeuge aus der Sterilisationsbeutel. Fügen eiskalt, sterile DPBS / 1% P / S zu einem kleinen Petrischale und auf Eis.
- Enthaupten P4 Math1-GFP / Nestin-GFP Maus Welpen mit großen chirurgischen Schere halten dann den Kopf nach unten mit feinen gebogenen Pinzette. Entfernen Sie die Haut und vorsichtig abziehen der Schädel mit # 5 feinen Pinzette dann aushöhlen das Gehirn aus dem Schädel mit einem Spatel und überträgt es auf die Petrischale mit DPBS / 1% P / S.
- Verwendung von # 5 feinen Pinzette vorsichtig die Kleinhirn vom Rest des Gehirns. Achten Sie darauf, einen Welpen zu einem Zeitpunkt, so schnell wie möglich zu sezieren.
- Sammeln ein Minimum von 8 Kleinhirn, um genügend NEPs für molekulare und funktionelle Analysen zu erhalten.
- Füllen Sie eine Einbettung Form von 2 x 2 x 2 cm mit 3% niedriger Schmelztemperatur Agarose-Lösung. Sicherzustellen, dass die Temperatur der Agarose nicht mehr als 37 ° C ist.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Kleinhirn durch Abtupfen sanft auf einem Labor Gewebe. Zeigen Kleinhirn in die Form in eine vertikale Position. Legen Sie die Form auf Eis, damit es schnell zu verfestigen. Werden ~ 4 cerebella pro Block.
- Erhalten liVing Gewebeschnitte mit einem vibrierenden Klinge Vibratom. Trim cerebella haltige Agarose-Block mit einer Rasierklinge. Kleben Sie die Agarose-Block auf die Platte Vibratom mit Kleinhirne in eine vertikale Position ausgerichtet.
- Füllen Sie den Boden der Vibratom mit eiskaltem sterilen DPBS / 1% P / S und Ort Eis darunter.
- Schnitt 600 um Schnitte durch die gesamte Länge des Kleinhirns. Sammeln Abschnitte aus dem Eiswürfelschale mit einem perforierten Löffel. Platz Abschnitte in einer Petrischale mit DPBS / 1% P / S auf Eis gefüllt.
3. Mikrodissektion und Zelldissoziation
- Legen Sie die Petrischale mit Gewebeschnitten unter einem Fluoreszenz-Binokular.
- Vorsichtig die EGL aus dem Rest der Kleinhirnschnitt mit feinen Pinzette durch Sezieren zwischen der GFP + Molekularschicht und der GFP + EGL (siehe gestrichelte Linie in Abbildung 1). Achten Sie darauf, jeden Teil des molekularen Schicht nicht enthalten, die dazu führen wirdKontamination von Nestin-exprimierenden Bergmann Gliazellen.
- Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich zu halten und das Gewebe auf Eis, um den Zelltod zu verhindern.
- Entfernen Sie die Agarose die umgebenden Gewebe, bevor Sie zum nächsten Schritt.
- Digest mit einer Papain-basiertes Protokoll, wie zuvor beschrieben, 2 um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die microdissected EGL Gewebe.
- Resuspendieren Zellen in FACS-Puffer für die Sammlung der GFP-positiven Zellen über FACS.
4. Zellsortierung und Oberflächen
- Sortieren Zellen für GFP-Fluoreszenz mit einer sterilen, Hochgeschwindigkeits Durchflusszytometer, die eine geeignete GFP-Filter und sammeln Zellen in FACS-Puffer auf Eis. Erhalten rund 100.000 NEPs von jedem P4 Kleinhirn.
- Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min. Verwenden Zellen sofort für die molekulare Analyse oder Kultur für weitere Experimente.
- Zur Kultivierung von Zellen, Wieder die Zellen in vorgewärmte NB / B27 medien und Platte auf PDL-beschichtete Deckgläser wie zuvor beschrieben 2.
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Representative Results
Wie in 1A gezeigt, wurden Kleinhirnschnitten von P4 Math1-GFP / Nestin-GFP-Mäuse hergestellt, in dem der Kleinhirn EGL wurde von GFP-exprimierenden BSP dominiert und die Molekularschicht wurde durch GFP-positive Gliazellen angereichert. (; 1A entlang gestrichelte Linie) zu NEP, die in den tiefen Teil der EGL befinden isolieren, wurden Scheiben zwischen der EGL und der Molekularschicht mikrodissektiert. Anatomisches BPLL (1B) wurden dann für die enzymatische Spaltung, gefolgt von FACS gesammelt.
Wie erwartet, eine Mehrheit (über 85%) von Zellen in dem sezierten EGL waren herkömmliche BSP, das für GFP (2A) positiv waren. NEP (GFP +) machen nur rund 5% der EGL Zellpopulation. Fast keine der Zellen waren doppelt positiv für GFP und GFP-basierten FACS-Analyse auf die. GFP +-Zellen durch FACS gereinigt, wurden in vitro kultiviert, um die Differenzierung zu untersuchen Potential. Wie in 2B gezeigt, Nissen ergab ausschließlich die zu β-Tubulin +-Neuronen nach 4 Tagen in der Kultur, was NEP sind linien eingeschränkten neuronalen Vorläuferzellen.
Durch dieses Protokoll Mikrodissektion wurden Nissen und BSP auch von der EGL von Ptc mangelKleinHirn gereinigt. Nach intrakraniellen Transplantation entwickeln NEPs MBs schneller verglichen mit BSP, die anzeigt, dass NEP besonders anfällig für onkogene Transformation 9 sind.
Abbildung 1. Bezeichnung der Region für die EGL Mikrodissektion. Fluorescent Bilder von P4 Math1-GFP / Nestin-GFP Tieren. (A) GFP-Expression in der EGL befindet, während die Mehrheit der GFP-Expression in der Molekülschicht. Mikrodissektion wurde entlang t getaner gelb gestrichelten Linie. (B) wurden für die beschäftigungspolitischen Leitlinien Gewebedissoziation gesammelt. Diese Zahl wurde von Li et al 9 geändert.
Abbildung 2. NEP stellen eine kleine Population von Zellen in der EGL und sind linien beschränkt neuronalen Vorläuferzellen. (A) Die Durchflusszytometrie Analyse der GFP +-Zellen aus mikrodissezierten EGL isoliert. (B) NEPs wurden unter Differenzierungsbedingungen für 4 Tage kultiviert und für β-Tubulin (rot) gefärbt und mit DAPI (blau) gegengefärbt. Diese Zahl wurde von Li et al modifiziert. 9
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Discussion
Die hier beschriebene Mikrodissektionsverfahren ist das erste Verfahren in der Lage, eine reine Population von lebenden Zellen für den Einsatz in der molekularen und funktionellen Analysen zu isolieren. Wie von Li et al. 9 gezeigt, NEP durch dieses Verfahren erhalten werden, können kultiviert werden und in verschiedenen Versuchen integriert werden und aufgrund ihrer hohen Reinheit kann auch für die Microarray-Analyse eingesetzt werden.
Es ist sehr wichtig, sich Zeit zu nehmen tüchtig mit diesem Mikrodissektion Technik zu werden. NEP sind im tiefen Bereich der EGL in unmittelbarer Nähe zu der Molekularschicht, in der Nestin-exprimierenden Bergmann Gliazellen könnte die NEP Zellisolierung kontaminieren und Kompromisse Reinheit entfernt. Mikrodissektion sollte daher konservativ durchgeführt, um sicher kontaminierenden Zellen in benachbarte Gewebe sind nicht enthalten zu machen. Der große Vorteil der hier beschriebenen Mikrodissektion Technik ist die Fähigkeit, lebende Zellen zu erhalten, die für furthe kultiviert werden könnenr Experimente. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass alle Schritte bei diesem Verfahren schnell durchgeführt werden und dass Gewebe auf Eis so viel wie möglich gehalten werden. Auch müssen alle Instrumente und Reagenzien steril sein. Nach diesen Schritten wird Zelltod und Zellkultur-Kontamination zu verringern. Darüber hinaus wird die Montage mehrerer Kleinhirn pro Agarose-Block bei der Verringerung der Verfahrenszeit zu unterstützen.
Diese Technik ist nicht die Isolation Nissen beschränkt und kann verwendet werden, um Zellen, die von anderen Bereichen des Kleinhirns, wie Gliazellen aus der Molekularschicht und neuronalen Stammzellen aus der weißen Substanz zu sammeln. Neben dem Kleinhirn, kann Mikrodissektion mit anderen Geweben, die erkennbar Regionen wie dem Hippocampus enthalten, beispielsweise verwendet werden. Die Verwendung von fluoreszierenden Transgene, wie hier verwendet, kann bei der Schaffung von Grenzen zu helfen oder zu identifizieren, für die Präparation Regionen, die besonders hilfreich bei der Gewebe, die leicht erkennbar Raum mangelt es sein kann, und sonst nicht in der Lage, m seinicrodissected. Diese Technik könnte daher in der Zelle helfen Reinigungen in einer Vielzahl von Forschungsbereichen und Anwendungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei James Oesterling für die Durchflusszytometrie Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-amerikanischen National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) und einer US-amerikanischen National Institute Postdoc-Stipendium (5T32CA009035-37, LWY) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
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