Isolering af Distinct cellepopulationer fra udviklingslandene lillehjernen ved mikrodissektion

Summary

Nestin-udtrykkende progenitorer er en nyligt identificerede population af neuronale stamceller i det udviklende cerebellum. Ved hjælp af mikrodissektion teknik præsenteres her i kombination med fluorescerende cellesortering, kan denne cellepopulation oprenses uden kontaminering fra andre cerebellare regioner og kan dyrkes til yderligere undersøgelser.

Abstract

Mikrodissektion er en ny teknik, der kan isolere specifikke områder af et væv og eliminere forurening fra cellulære kilder i tilstødende områder. Denne fremgangsmåde blev først anvendt i studiet af Nestin-udtrykkende progenitorer (Neps), en nyligt identificerede population af celler i cerebellum ydre vækstlag (EGL). Brug mikrodissektion i kombination med fluorescerende cellesortering (FACS) blev en ren population af Neps indsamles separat fra konventionelle granule neuron prækursorer i EGL og fra andre kontaminerende Nestin-udtrykkende celler i cerebellum. Uden mikrodissektion ville funktionelle analyser af Neps ikke have været muligt med de nuværende metoder til rådighed, såsom Percoll gradientcentrifugering og laser capture mikrodissektion. Denne teknik kan også anvendes til brug med forskellige væv, der indeholder enten genkendelige regioner eller fluorescens-mærkede celler. Vigtigst er det, en stor fordel ved denne microdissection teknik er, at isolerede celler er levende og kan dyrkes til yderligere eksperimenter, som i øjeblikket ikke er muligt med andre beskrevne metoder.

Introduction

Lillehjernen består af flere cellelag, som hver indeholder forskellige celletyper. Under udvikling, indeholder EGL prolifererende granulat neuron forstadier (BNI), mens den molekylære lag og Purkinje lag indeholder Bergmann Glia og Purkinje neuroner hhv. Dybt i lillehjernen ligger den hvide substans, der indeholder neurale stamceller (NSC) og oligodendrocytter ^1.

Sonic pindsvin (Shh) spiller en afgørende rolle i reguleringen af cerebellar udvikling og i særdeleshed det fremmer udbredelsen af BNI via binding til sin receptor Patched (PTC), en negativ regulator af Shh signalering ^2-4. Afvigende aktivering af Shh signalering genererer medulloblastoma (MB), den mest almindelige maligne hjernetumor hos børn ^5,6.

PTC mutant MB transgene musemodeller er stærke værktøjer til studiet af MB og udvikle tumorer ligner menneskelig MB ^7,8. Ved hjælp af dissemus, blev det opdaget, at BNI er cellen af oprindelse for pindsvin-typen MB ^7. Endvidere, ud over BNI, har vi for nylig identificeret en unik population af neuronale progenitorceller inden EGL af udviklingen i lillehjernen, der også kan give anledning til MB. Disse celler udtrykker høje niveauer af typen VI mellemliggende filamentprotein, Nestin, og kaldes Neps ^9. Neps ligger inden for den dybe del af EGL og findes transient kun i neonatal cerebellare udvikling. De er forpligtet til at granulatet cellelinje som BNI, men adskiller sig, som de er i hvile og ikke udtrykker Math1, et veletableret markør for konventionelle BNI ^10. Desuden Neps give anledning til MB mere effektivt end BNI efter aktivering af Shh signalvejen ^9, hvilket gør dem et hidtil ukendt oprindelse til MB tumorigenese.

Vi har tidligere isolerede Neps fra cerebellare EGL på postnatal dag 4 (P4) ved mikrodissektion teknikher ⁹ beskrevne. Mikrodissektion via direkte mikroskopisk visualisering af væv giver mulighed for specifik dissektion af cerebellare EGL. Dette er nødvendigt, da Nestin også udtrykkes ved NSC i cerebellare hvide substans og ved Bergmann glia i den molekylære lag ^1,7,11,12, og det var afgørende, at disse celler ikke medtages, da de ville forvirre analyse. Celler isoleret fra Mikrodissekterede væv umiddelbart kan anvendes til molekylær analyse, eller de kan dyrkes til yderligere anvendelser.

For at hjælpe i specielt microdissecting EGL og til yderligere oprensning Neps blev Math1-GFP (grønt fluorescerende protein) mus krydset med Nestin-fælles fiskeripolitik (cyan fluorescerende protein) mus. Transkriptionsfaktoren Math1 specifikt udtrykt af BNI, og GFP-ekspression er tydeligt i EGL ^9,13. Mus Nestin-FFP udtrykker en nuklear form for fælles fiskeripolitik og kan nemt visualiseres i den molekylære lag ^9,14. Sammen GFP og FFP ekspression skabe grænser for mikrodissektion af EGL (se figur 1). FFP-positive Neps blev derefter isoleret ved FACS efter enzymatisk dissociering af dissekerede EGLS.

I øjeblikket er den mest anvendte metode til at isolere celler fra EGL er Percoll-gradientcentrifugering af hele cerebellar væv ^15,16. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke i stand til helt at udelukke Nestin +-cellepopulationer fra det molekylære lag og hvid substans, og derfor ikke kan anvendes til undersøgelse af Neps. Laser capture microdissection, som bruger overførsel af laserenergi til fjernelse af celler af interesse, er en anden metode, der anvendes til at isolere specifikke celler i en heterogen væv ^17,18 men indfangede celler kan kun anvendes til udvinding af DNA, RNA og protein og er ikke stand til at blive dyrket.

Denne protokol giver en måde til specifikt at isolere en levende, ren population af Neps fra EGL.Denne teknik kan også anvendes på forskellige vævstyper, der enten genkendelige anatomiske arkitektur eller fluorescensmærkede celler / områder. Derfor er den største fordel ved at inkorporere denne nye mikrodissektion teknik i celleisolering protokoller er, at cellerne kan isoleres fra bestemte vævsområder at fjerne kontaminerende tilstødende væv og cellerne kan opsamles umiddelbart til analyse eller dyrkes til andre anvendelser.

Protocol

Anvendelse af dyr i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med procedurer, der er godkendt af Fox Chase Cancer Center Animal Care og brug Udvalg.

1. Fremstilling af instrumenter, løsninger og Dækglas

1. Clean to sæt af # 5 fine pincet, et sæt af # 7 fine buet pincet, et stort kirurgisk saks, en microdissecting saks, en spatel og en hulske. Anbring instrumenterne i en selvlukkende sterilisering pose og autoklave. Hold instrumenter pose indtil den er klar til brug.
2. Forbered en 3% lavtsmeltende agaroseopløsning.
   1. Tilføj 1,5 g agarose i 50 ml sterilt Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) og derefter placere i mikroovn og varme, indtil der kommer bobler. Swirl kolbe og genopvarmning, indtil al agarose er opløst. Bland opløsningen med en omrører før opvarmning klumper vises.
   2. Opbevar opløsningen i et 37 ° C vandbad indtil brug.
   3. Til langvarig opbevare, opbevares agaroseopløsningen til fremtidig brug ved stuetemperatur eller ved 4 ° C i flere måneder. Genopvarmning i mikrobølgeovn til at flydende. Ved gentagen opvarmning af agaroseopløsningen vejes kolben før opvarmning for at bevare sin oprindelige vægt med varmt sterilt destilleret vand.
3. Forbered følgende løsninger for papain-baserede celledissociering som tidligere beskrevet ^2:
   1. En papain opløsning med papain (100 U / ml), cystein (0,2 mg / ml) og DNase (250 U / ml) i steril phenolrødt indeholdende DPBS.
   2. En ovimucoid opløsning med bovint serumalbumin (BSA; 8 mg / ml), soyabønnetrypsininhibitor (8 mg / ml)) og DNase (250 U / ml) i steril phenolrødt indeholdende DPBS.
      Filtersteriliser begge løsninger og justere pH-værdien til at returnere oprindelige farve af phenolrødt-holdigt DPBS.
4. Forbered celledyrkningsmedier (NB / B27): supplere basale medier med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin (P / S) og B27 supplement. Filter sterilisere og beskytte mod lys. Ækvilibrer medier ved 37 ° C og 5% _CO2 før brug.
5. Forbered FACS buffer: 5% føtalt bovint serum (FBS) i DPBS. Tilføj 2,5 ml FBS til 47,5 ml DPBS.
6. Forbered poly-D-lysin (PDL) overtrukne dækglas.
   1. Autoklave nye dækglas.
   2. Coat dækglassene med PDL (100 ug / ml i sterilt destilleret vand) og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C eller stuetemperatur natten over.
   3. Vask dækglas med sterilt destilleret vand. Vask en gang med NB / B27 medier. Lad dækglas tørre helt i vævskultur hætte før brug.

2. Dissektion og Udarbejdelse af vævssnit

1. På dagen for dissektion, tørre ned dissektion område med 70% ethanol og låg med en absorberende pude.
2. Fjern dissektion værktøjer fra sterilisering pose. Tilføj iskold, sterile DPBS / 1% P / S til en lille petriskål og sted på is.
3. Halshugge P4 Math1-GFP / nestin-FFP museunger med store kirurgiske saks derefter holde hovedet ned med fine buede pincet. Fjern huden og forsigtigt skræl væk kraniet med # 5 fin pincet derefter øse ud af hjernen fra kraniet ved en spatel, og overføre det til petriskål indeholdende DPBS / 1% P / S.
   1. Brug af # 5 fine pincet forsigtigt adskille lillehjernen fra resten af ​​hjernen. Vær sikker på at dissekere en hvalp på et tidspunkt så hurtigt som muligt.
   2. Indsamle mindst 8 cerebella for at opnå nok Neps for molekylære og funktionelle analyser.
4. Fyld en indlejring skimmel måler 2 x 2 x 2 cm med 3% lavtsmeltende agaroseopløsning. Sikre, at temperaturen agarose er ikke mere end 37 ° C.
5. Fjern overskydende væske fra lillehjernen ved at duppe forsigtigt på et laboratorium væv. Placer cerebellum i skimmel i en lodret position. Anbring formen på is for at lade det størkne hurtigt. Brug ~ 4 cerebella pr blok.
6. Opnå liVing vævssnit med en vibrerende klinge vibratome. Trim cerebella indeholdende agarose blok med et barberblad. Lim agarose blok til vibratome plade med cerebella orienteret i en lodret position.
7. Fyld bakken af ​​vibratome med iskolde sterile DPBS / 1% P / S og sted is nedenunder.
   1. Skær 600 um snit gennem hele længden af ​​lillehjernen. Saml sektioner fra isen bakken ved hjælp af en hulske. Placer sektioner i en petriskål fyldt med DPBS / 1% P / S på is.

3. mikrodissektion og celledissociationsbuffer

1. Placer petriskål indeholdende vævssnit under en fluorescerende dissektionsmikroskop.
   1. Adskil forsigtigt EGL fra resten af cerebellare sektion ved hjælp af fine tænger ved dissekering mellem FFP + molekylære lag og GFP + EGL (se stiplede linie i figur 1). Vær omhyggelig med ikke at inkludere nogen del af den molekylære lag, hvilket vil resultere ikontaminering af Nestin-udtrykkende Bergmann glia.
   2. Udfør dette trin så hurtigt som muligt og holde væv på is for at undgå celledød.
   3. Fjern agarose omgiver væv før du fortsætter til næste trin.
2. Fordøje Mikrodissekterede EGL vævet med et papain-baseret protokol som tidligere beskrevet ² til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
   1. Re-suspendere celler i FACS-buffer til opsamling af FFP-positive celler via FACS.

4. cellesortering og Belægning

1. Sorter celler til den fælles fiskeripolitik fluorescens ved hjælp af en steril, høj hastighed flowcytometer indeholder et passende filter fælles fiskeripolitik og indsamle celler i FACS-buffer på is. Opnå cirka 100.000 Neps fra hver P4 lillehjernen.
2. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 min. Brug celler straks for molekylær analyse eller kultur til yderligere eksperimenter.
3. Til kultur-celler, re-suspendere cellerne i forvarmet NB / B27 media og plade på PDL-overtrukne dækglas som tidligere beskrevet ^2.

Representative Results

Som vist i figur 1A blev cerebellare skiver fremstillet ud fra P4 Math1-GFP-mus / Nestin-FFP, hvor cerebellare EGL var domineret af GFP-udtrykkende BNI og den molekylære lag blev beriget med FFP-positive glialceller. Til isolering Neps der er placeret i den dybe del af EGL, blev skiver mikrodissekeres mellem EGL og den molekylære lag (langs stiplet linje, figur 1A). Dissekeret EGLS (figur 1B), blev derefter opsamlet enzymatisk dissociation efterfulgt af FACS.

Som forventet, flertallet (mere end 85%) af celler i det dissekerede EGL var konventionel BNI, som var positive for GFP (figur 2A). NEPS (CFP +) kun tegner sig for omkring 5% af EGL cellepopulationen. Næsten ingen af ​​cellerne var dobbelt-positive for GFP og FFP baseret på FACS-analyse. FFP + celler oprenset ved FACS, blev dyrket in vitro for at undersøge differentiering potential. Som vist i figur 2B Neps udelukkende gav anledning til β-tubulin + neuroner efter 4 dage i kultur, hvilket tyder Neps er slægt-begrænset neuronale stamceller.

Ved denne mikrodissektion protokol blev Neps og BNI også oprenset fra EGL PTC mangelfuld lillehjernen. Ved intrakraniel transplantation Neps udvikle MBs hurtigere sammenlignet med BNI, hvilket indikerer, at Neps er særligt modtagelige for oncogen transformation ^9.

Figur 1. Identifikation af regionen i EGL mikrodissektion. Fluorescerende billeder fra P4 Math1-GFP / dyr Nestin-fælles fiskeripolitik. (A) GFP-ekspression er placeret i EGL, mens størstedelen af den fælles fiskeripolitik udtryk ligger i den molekylære lag. Mikrodissektion blev udført langs than gul stiplet linje. (B) EGLS blev indsamlet til væv dissociation. Dette tal er blevet ændret fra Li et al ^9.

Figur 2. Neps udgør en lille population af celler i EGL og er slægt-begrænset neuronale stamceller. (A) Flowcytometrianalyse af FFP + celler isoleret fra Mikrodissekterede EGL. (B) Neps blev dyrket under differentiering betingelser i 4 dage og farvet for β-tubulin (rød) og modfarvet med DAPI (blå). Dette tal er blevet ændret fra Li et al. ⁹

Discussion

Den her beskrevne mikrodissektion metode er den første procedure stand til at isolere en ren population af levende celler til anvendelse i molekylære og funktionelle analyser. Som det fremgår af Li et al. ^9. Neps opnået ved denne metode kan dyrkes og inkorporeres i forskellige eksperimenter og på grund af deres høje renhed, kan også anvendes til microarray analyse.

Det er meget vigtigt at tage tid til at blive dygtige med denne mikrodissektion teknik. Neps er placeret i den dybe region EGL i meget tæt nærhed til det molekylære lag, hvor Nestin-udtrykkende Bergmann glia kan forurene NEP celleisolering og kompromittere renhed. Mikrodissektion skal derfor ske konservativt for at sikre kontaminerende celler i tilstødende væv ikke er inkluderet. Den største fordel af mikrodissektion her beskrevne teknik er evnen til at opnå levende celler, som kan dyrkes til further eksperimenter. På grund af dette, er det afgørende, at alle trin i løbet af denne procedure skal gøres hurtigt, og at væv holdes på is så meget som muligt. Desuden skal alle instrumenter og reagenser være sterile. Efter disse skridt vil reducere celledød og forurening cellekultur. Desuden vil montere flere cerebella pr agarose blok støtte i at reducere behandlingstiden.

Denne teknik er ikke begrænset til isolering af Neps og kan bruges til at indsamle celler fra andre områder af cerebellum, såsom gliaceller fra molekylære lag og neurale stamceller fra den hvide substans. Udover cerebellum kan mikrodissektion anvendes med andre væv, der indeholder genkendelige regioner, såsom hippocampus, f.eks. Brugen af ​​fluorescerende transgener, som udnyttes her, kan hjælpe med at skabe grænser eller identificere områder for dissektion, som kan være særligt nyttigt i væv, der mangler let identificerbare områder og ellers ikke ville være i stand til at være microdissected. Denne teknik kan derfor støtte i celle oprensninger i en bred vifte af forskningsområder og applikationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
Ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144