Abstract
Muller-celler är de främsta gliaceller i näthinnan. Deras slut fötterna bildar gränserna för näthinnan vid de yttre och inre begränsande membran (ILM), och i samband med astrocyter pericyter och endotelceller de etablerar blod-retinala barriären (BRB). BRB begränsar materialtransport mellan blodet och näthinnan medan ILM fungerar som en källare membran som definierar histologiskt gränsen mellan näthinnan och glaskroppen hålrum. Märkning Müller-celler är särskilt relevant att studera fysiska tillstånd näthinnans hinder, eftersom dessa celler är en integrerad del av BRB och ILM. Både BRB och ILM ofta ändras näthinnesjukdom och ansvarar för sjukdomssymptom.
Det finns flera väl etablerade metoder för att studera integritet BRB, såsom Evans blue assay eller fluorescein angiografi. Dessa metoder behöver dock inte ge information om omfattningen av BRB permeabilitet to större molekyler, i nanometerområdet. Dessutom behöver de inte ge information om tillståndet i andra retinala hinder såsom ILM. Att studera BRB permeabilitet tillsammans retinal ILM, använde vi en AAV baserad metod som ger information om permeabilitet BRB till större molekyler samtidigt indikerar tillståndet i ILM och extracellulära matrixproteiner i sjukdomstillstånd. Två AAV varianter är användbara för sådan studie: AAV5 och ShH10. AAV5 har en naturlig tropism för fotoreceptorer, men det kan inte komma över till den yttre näthinnan när det administreras i glaskroppen när ILM är intakt (dvs i vildtyp näthinnor). ShH10 har en stark tropism mot gliaceller och kommer att selektivt märka Müller Glia i både friska och sjuka näthinnor. ShH10 ger effektivare gen leverans i näthinnor där ILM äventyras. Dessa virala verktyg tillsammans med immunohistokemi och blod-DNA-analys kasta ljus på tillståndet i retinala hinder i sjukdomen.
Introduction
Muller-celler är den huvudsakliga glia komponenten av näthinnan. Morfologiskt de spänner näthinnan radiellt och deras endfeet, i kontakt med glaskroppen, möter ILM och hemliga komponenterna i den senare. ILM är en basalmembran bestående av ett tiotal olika extracellulära matrixproteiner (laminin, agrin, perlecan, nidogen, kollagen och flera heparinsulfat proteoglykaner). Under utveckling är dess närvaro oumbärlig för retinal histogenes, navigering av optiska axoner, och överlevnaden av ganglieceller 1-3. Dock är ILM oväsentligt i vuxen näthinnan och kan opereras bort i vissa patologier utan att orsaka skada på näthinnan 4. I genterapi, blir detta membran en fysisk barriär för effektiv transduktion av näthinnan med hjälp AAV genom intravitreal injektion 5.
Genom den omfattande arborization sina processer, Müller-celler ger närings och reglerande Support för att både retinala neuroner och vaskulära celler. Müller-celler är också involverade i regleringen av näthinnans homeostas, i bildandet och underhåll av BRB 6. Tight junctions mellan näthinnans kapillärendotelceller, Müller celler, astrocyter och pericyter bildar BRB. BRB hindrar vissa ämnen kommer in i retina.In många sjukdomar som diabetesretinopati, retinal ocklusion och luftvägssjukdomar, hypoxi av näthinnan orsakar läckage genom BRB 7-9. Detta brott är förenat med en ökad vaskulär permeabilitet leder till vasogent ödem, näthinneavlossning och retinal skador.
Müller-celler är tätt förknippade med blodkärl och basalmembranet, spelar en viktig roll i både BRB och ILM integritet. Följaktligen märkning Müller gliaceller är särskilt relevanta för studien av den fysiska tillstånd av dessa retinala hinder.
Klassiskally, är BRB permeabilitet mäts med användning av Evans blue assay bestående av systemisk injektion av Evans blå färgämne, som binder icke-kovalent till plasmaalbumin. Denna analys mäter albuminläckage (protein av mellanstorlek, ~ 66 kDa) från blodkärlen i näthinnan (se Protokoll § 5) 10. Alternativt kan den vaskulärt läckage visualiseras genom fluorescens retinala angiografi bestyrkande av läckage av fluorescein (liten molekyl, ~ 359 Da; se Protokoll § 6) 11. Ändå båda metoderna tillåter utvärdering av BRB permeabilitet för små molekyler och proteiner, men de ger ingen information om ILM integritet.
Därför, för att studera BRB permeabilitet, använde vi en AAV baserad metod som ger information om BRB permeabilitet för större molekyler (t.ex., AAV-partiklar, 25 nm diameter). Partiklar kan faktiskt vår metod upptäcka förekomst av AAV transgen i blodet, vilket skulle tyda på att ~ 25 nm diameter skullekunna infiltrera in i blodomloppet. Denna metod ger också information om strukturen i ILM och extracellulära matrixproteiner vid patologiska tillstånd. Två AAV varianter är användbara för sådan studie: AAV5 och ShH10. Subretinally injiceras, har AAV5 en naturlig tropism för fotoreceptorer och retinal pigment epitel 12 men det kan inte komma över till den yttre näthinnan när det administreras i glaskroppen i vildtyp näthinnor med intakt ILM 5,13. ShH10 är en AAV-variant som har utformats för att specifikt rikta gliaceller över nervceller 14,15. ShH10 etiketter selektivt Müller celler i både friska och sjuka näthinnor med ökad effektivitet i näthinnor med nedsatt barriärer 16. Dessa virala verktyg tillsammans med immuhistochemistry och blod-DNA-analys ger information om tillståndet i retinala barriärer och deras engagemang i sjukdom (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som används i denna studie var omhändertagna och hanteras enligt Arvo Uttalande om användning av djur i oftalmisk och Vision Research.
1. Produktion av rekombinant AAV (rAAV) av Transient Transfektion av HEK-293-celler 17,18
OBS: Se McClure C, JUPITER (2011) 19.
- Rena en storskalig plasmidpreparation (minst 1 mg / ml) av AAV vektorplasmider. Använd 3 plasmider. AAV helper plasmid som bär replikationen och kapsid-generna utan AAV inverterade terminala repetitioner ITR, transgenen expressionskassetten som bär AAV ITR kallad överföringsplasmid, och plasmiden levererar adenovirus helper generna E2, E4, och VA-RNA-gener som avses till såsom pHELPER.
- Transfektera 293 celler med dessa tre plasmider som använder polyetylenimin (eller annan transfektionsreagens). Över 80% av transfektionseffektiviteten är nödvändigt för god viRAL avkastning.
- Rena rekombinant AAV från 293 cellysat på en iodixanol lutning. 15%, 25%, 40%, och 60% jodixanol används för att erhålla gradienten. Samla 40% iodixanol fraktion innehållande AAV-partiklar, koncentrera fraktionen efter ultracentrifugering vid 500.000 xg under 1 timme och buffertutbyte mot PBS (fosfatbuffrad saltlösning) med 0,001% Pluronic.
- För att bestämma viral genomisk titer 20, utför en DNAse ProteinaseK sammandrag följt av QPCR. Framåt och bakåt primers förstärka 62 bp region som ligger i AAV2 ITR. För plasmiden standarden, är sonden märkt med FAM och har ett svart hål släckare (BHQ).
- Utför qPCR (kvantitativ polymeraskedjereaktion) i en slutlig volym av 25 pl genom att använda 340 nM omvänd ITR primer, 100 nM framåt ITR primer, 100 nM AAV2 ITR sond, 0,4 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1 x Platinum Taq Buffert, 1U Platinum Taq och 5 pl mall (standard, prov och ingen mall kontroll).
- Förstandarden, använda plasmiden för transfektion i 7 x 10-faldiga seriespädningar (5 | il vardera av 2 x 10 9 till 2 x 10 3 rade genom / ml resulterade i en slutlig koncentration från oktober 10-April 10 ledare för genom / ml).
- Påbörja programmet genom ett initialt denatureringssteg vid 95 ° C under 15 min följt av 40 cykler av denaturering vid vid 95 ° C under 1 minut och annealing / extension vid 60 ° C under 1 min. Förvaras vid 4 ° C under en kortvarig lagring eller vid -20 ° C under långa lagringstider.
2. Intravitreal Injektion av AAV
- Söva C57BL6J möss med ketamin (50 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) och verifiera förlusten av rätande reflex, tillbakadragande reflex och svans nypa svar indikerar en ordentlig anesthetization. Dilate elever genom korneal applikation av neosynephrine 5% och mydriaticum 0,5% ögondroppar. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Passera en ultrafina 30 G disposable nål genom ekvatorn och intill limbus, in i glaskroppen (se Chiu K, JUPITER (2007) 21). Spruta 1 pl lager innehållande 1 till 4 x 10 11 rd av ShH10-GFP eller AAV5-GFP med direkt observation av nålen i mitten av den glaskroppskaviteten (Figur 1). Använd ett öga som en kontroll för ILM experiment. Injicera båda ögonen för BRB experiment. Applicera en anti-inflammatorisk och antibakteriell topikal behandling på injicerade ögon.
- Vidga elever med neosynephrine och mydriaticum ögondroppar för avbildning. Utför fundus undersökningar med ett öga funduskamera att följa GFP (grönt fluorescerande protein) uttryck 1 vecka, 2 veckor, 1 månad och 2 månader efter intravitreal injektion (Figur 1). Offra möss genom CO2 inhalation 1 till 2 månader efter injektion.
3. Immunohistokemi
- För retinala kryosnitt (Figur 1), dissekera enukleerade ögon för att ta bort lENS och hornhinnan, och nedsänkning fix i 4% paraformaldehyd under 1 timme.
- Cryoprotect de tidigare fastställda ögon i 10% sackaros under 1 h vid rumstemperatur, 20% sackaros under ytterligare timme vid rumstemperatur. Cryoprotect i 30% sackaroslösning, över natten vid 4 ° C. Frys och bädda ögonmusslor i bädda harts som Cryo-matris. Gör 10 um kryosektioner och montera på diabilder specialbehandlade för frysta vävnadssnitt och att förbättra vävnads följsamhet under färgning.
- Permeabilize sektioner med 0,1% Triton X100 i PBS pH 7,4 under 5 min. Tvätta 2x i PBS och blockera under 1 h vid rumstemperatur i PBS med 1% BSA, 0,1% Tween 20.
- För retinala flatmounts (Figur 1), fixa enukleerade ögon i 4% paraformaldehyd i 15 min för att underlätta dissekering.
- I 15-30 minuter, dissekera ögonen för att ta bort hornhinnan och linsen. Separera näthinnan från retinala pigmentepitel (RPE) och sklera genom att skära runt ora serrata ochsynnerven. Fördjupa i 4% paraformaldehyd i ytterligare 30 minuter att fixa näthinnan och fluorescerande proteinet i omvandlade retinala celler (fixering får inte överstiga 24 timmar). Tvätta 5 minuter i steril PBS, pH 7,4.
- Ändra PBS till blockeringsbuffert (PBS med 1% BSA, 2% normalt get eller åsna serum, 0,5% Triton X-100), och inkubera i blockeringsbuffert för antingen 4 h vid rumstemperatur eller 4 ° C över natten.
- Inkubera vävnader med primära antikroppar i blockerande buffert för antingen 4 h vid rumstemperatur eller vid 4 ° C över natten. Tvätta 3x med PBS.
OBS: De antikroppar som används är följande: anti-laminin (1 / 1.000) märkning av ILM, anti rodopsin klon 4D2 (1/500) märkning stavar, anti-glutaminsyntetas klon GS-6 (1 / 1.500) märkning Müller-celler , PNA Lektin (1/40) märkning kottar. - Inkubera vävnader med ett: 500 utspädning av Alexa Fluor konjugerade sekundära antikroppar i blockerande buffert under 1 h (kryosnitt) eller 2 h (flatmounts) vid rums tempeperatur och skyddas från ljus. Tvätta 3x med PBS.
- Gör avlösande snitt till näthinnan och flatmount det på en glasskiva med antingen fotoreceptorn eller näthinnegangliecell (RGC) vänd uppåt. Lägg vatten mountingmedium, applicera täck och förvara vid 4 ° C.
- Utför konfokalmikroskopi på laserskanning konfokalmikroskop. Förvärva bilder i sekvens rad för rad, för att minska excitation och emissions överhörning. Definiera steg storleken enligt Nyquist-Shannons samplingsteorem. Använd exponeringsinställningar som minimerar övermättade pixlar i de sista bilderna. Process 12-bitars bilder med Fiji, projekt Z-avsnitt på ett enda plan med hjälp av maximal intensitet i Z-projektfunktion och slutligen konvertera till 8-bitars RGB-färgläge.
4. PCR-analys av Mouse blodprover
- Injicera 100 | il lager innehållande 1-4 x 10 11 partiklar av en AAV-GFP in i penilvenen hos bedövade C57BL6J-möss (5% av isofluranför induktion i en nära kammaren och 2,5% av isofluran genom en noskon under operation) med användning av en insulinspruta med en ultra-fin 6 mm nål. Detta djur kommer att fungera som en positiv kontroll av cirkulerande AAV-partiklar.
- Blodprov från mus svans före injektionen och 3 h, 24 h, 2 dagar och 3 dagar efter ShH10 intravitreal injektion eller efter intrapenile injektion (Figur 1). Om 10-20 pl samlas i heparin rör. Offra möss genom CO2 inandning efter fullgörande av det förfarande.
- Utdrag iskt DNA från blodprover med utvinning kit som du väljer.
- Utför PCR-förstärkning av genomiskt DNA. För detta protokoll används följande primerpar: GFP, känna 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisens 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Följande PCR-programmet utfördes: 95 ° C 2 min (1 cykel); 95 ° C 45 sek, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sek (30 cykler); 72 ° C 5 min (1 cykel);4 ° C hold.
5. Valfritt Evans Blue Method
OBS: Kvantifiera vaskulär permeabilitet genom att mäta albuminläckage från blodkärl i näthinnan med hjälp av Evans blue metoden 10.
- Förbered Evans Blue färgämne genom upplösning i en normal saltlösning (6 mg / ml), sonikering under 5 minuter med ultraljud, och filtrering genom ett 5 pm filter.
- Söva C57BL6J möss (isofluran inandning, se steg 4.1), kontrollera förlusten av rätande reflex, tillbakadragande reflex och svans nypa svar indikerar en ordentlig anesthetization, och injicera Evans blue (45 mg / kg) genom penis ven (Figur 1). Kontrollera att tassar, nospartiet, och öron möss blivit klart blå efter Evans blue injektion, bekräftar upptag och fördelning av färgämnet.
- Bedöva C57BL6J-möss 3 h efter injektionen av färgämnet med ketamin (50 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) och verifiera förlusten av righting reflex indikerar en ordentlig anesthetization. Prov intracardially ca 500 | il blod i heparin rör och perfundera möss för 2 min, via den vänstra ventrikeln med en citratbuffert (0,05 M, pH 3,5; upplösa 7,8 g citronsyra och 3,8 g natriumcitrat i 1 L destillerat vatten) förvärmda till 37 ° C för att förhindra vasokonstriktion. Möss avlivas via perfusion.
- Efter perfusion, enucleate och försiktigt dissekera båda ögonen under en operationsmikroskop för att samla näthinnor (se avsnitt 3.2). Torra näthinnor i en centrifugalindunstare över natten, väga, och extrahera Evans blåfärg genom inkubering näthinnor med 100 | il av formamid för 18 h vid 65 ° C med skakning (100 xg). Centrifug näthinnan prover i 30K omega filterrör vid 20,798.5 xg under 2 timmar vid 4 ° C och centrifugera blodprov vid 20,798.5 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Använd båda supernatanter att mäta absorbansen. Bestäm absorbansen för varje prov genom att subtrahera maximalt absorbansen for Evans blue vid 620 nm till absorbansen minimum vid 740 nm. Beräkna Evans blue-koncentrationen i plasma och näthinnan från en standardkurva av Evans blå i formamid. Uttryck BRB permeabilitet i mikroliter av Evans-blått per gram torr näthinnan per timme (xl plasma / g retinal torrvikt / h).
6. Valfritt fluoresceinangiografi
OBS: Läckage från retinala blodkärl i möss kan visualiseras genom intraperitoneal injektion av natrium-fluorescein.
- Söva C57BL6J möss (isofluran inandning, se steg 4.1) och vidga elever med ögondroppar (neosynephrine och mydriaticum). Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Injicera intraperitonealt ,01-0,02 ml 10% natrium-fluorescein i 0,1 ml steril saltlösning för fluorescein angiografi.
- Samla bilder av båda ögonen efter injektion med hjälp av en ögonbottenkamera. Sacrifice möss genom CO 2 inandning efter proförfarande.
OBS: 20 sek är nödvändiga för de retinala kärl för att bli synliga på angiografi. Bilder måste fångas mellan min max 3-10 efter fluorescein injektion. De läckage fläckar (om sådan finns) är observer efter 2,5 minuter. Vid senare tidpunkter bildkvaliteten går förlorad på grund av natriumfluorescein diffunderar in i glaskroppen, alltså bara bilder strax erhållits efter används för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi förväntar sig en utökad retinal transduktion av Muller gliaceller använder ShH10 om djurmodellen visar störningar i strukturen av ILM (Fig 2A - B). Till exempel har vi visat att i avsaknad av Dp71, ShH10 mål specifikt men mer effektivt Müller gliaceller genom intravitreal injektion, vilket indikerar ökad permeabilitet av ILM i denna mus linje jämfört med vildtypsmöss 16 (figur 2C - F).
AAV5 kan också användas som en indikator på ILM permeabilitet. AAV5, ineffektiv genom intravitreal injektion i vildtypsmöss blir starkt effektiva i gen leverans till fotoreceptorer i möss med nedsatt retinala hinder såsom Dp71-null möss 16 eller i andra retinala degeneration 22 (Figur 2G - H). Detta bekräftar ILM desorganisation och potentiella permeabilitet increas vidaree på extracellulära matrix som omger näthinnans nervceller.
Vi fann att det BRB uppdelning av Dp71-null möss förblir selektiv till AAV-partiklar, eftersom inga spår av AAV hittades i blodprover av intravitrealt injicerat Dp71-null möss 16 (Figur 3).
Figur 1:. Schematisk representation av den allmänna protokollet Efter AAV produktion, är partiklar injiceras in i glaskroppen eller in i penilvenen till sövda vuxna möss. Fundus bilder med Micron III kamera utförs för att följa GFP uttryck. GFP uttrycksmönster analyseras på näthinnan kryosektioner och flatmounted näthinnor tack vare immunohistokemi och konfokala bilder. AAV passage genom BRB bedöms av PCR-analys på blodprover som kommer från intravitrealt eller intrapenially injicerade möss, jagör att påvisa förekomsten av GFP-sekvens, partiklar indikator på AAV närvaro i blodomloppet.
Figur 2: ILM permeabilitet för AAV transduktion Konfokala bilder av flatmounted vildtyp och Dp71-null näthinnor märkt med en pan-laminin antikropp (A, B). (Skala bar: 50 pm). Fundus bilder som visar GFP-uttryck (C, D). Flatmounted näthinnor en månad efter ShH10-GFP intravitreal injektion (E, F). Tredimensionell beredning (E *) i det område som anges med en asterisk i E visar transducerade Müller gliaceller i grönt och astrocyter i rött (anti-GFAP antikropp). Flatmounted näthinnor en månad efter intravitreal injektion av AAV5-GFP (G, H) (skala bar: 500 nm). Konfokal bild av området anges med en asterisk i H visar omvandlade fotoreceptorer i grönt och kotte yttre segment i rött (PNA lektin färgning) (H *). Den vänstra kolumnen visar resultat från vildtyp mus näthinnor och mittspalten visar resultat från Dp71-null mus näthinnor. Schemat (I) representerar AAV transduktion av näthinnan med komprometterade barriärer som Dp71-null näthinnan, genom glaskroppen. Förkortningar: CV, koroidala fartyg; RPE, retinal pigment epitel; PHR, fotoreceptorceller (stavar och tappar); MGC, Muller gliaceller; HC, horisontella celler; BC, bipolära celler; AC, amakrina celler; M, mikroglia; EG, endotelceller; P, pericyter; GC, ganglieceller; A, astrocyter; ILM, inre begränsande membran; V, vitros; AAV, adenoassocierat virus. (Re-print med tillstånd från Vacca Glia (2013) 16, # 3483740951391 et al.,).
tp_upload / 52451 / 52451fig3.jpg "/>
Figur 3: BRB permeabilitet för AAV-partiklar PCR-amplifiering av GFP transgen extraherats från mus blodprov.. Möss antingen injiceras intravitrealt (IVT) med ShH10-GFP eller intrapenially (IP) med AAV-GFP vid olika tidpunkter efter injektion. Lane 5-18, udda nummer för vildtypsmöss och jämna nummer för Dp71-null möss; bana 2, 1 ng av AAV-plasmid, pTR-SB-smCBA-hGFP; lane 3, vatten; körfält 5-6, blod DNA före injektion; banorna 7-8, 3 h efter IVT; körfält 9-10, 24 timmar efter IVT; körfält 11-12, 24 timmar efter IP; lanes 13-14, 48 h efter IVT; körfält 15-16, 48 timmar efter IP; lanes 17-18, 72 h efter IVT; körfält 19-20, 72 timmar efter undersökningsperioden. Banorna 1 och 4, Invitrogen skala stege (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 bp. (Åter ut med tillstånd från Vacca Glia (2013) 16, # 3483740951391 et al.,).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den BRB reglerar utbyte av molekyler mellan blod och näthinnan. Dess fördelning är förknippad med olika sjukdomar såsom diabetesretinopati eller åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Vi visade nyligen att i ett dystrofin knock-out mus, som visar genomsläpp BRB blir näthinnan mer tillåt till genleverans medierad av adenoassocierade virala vektorer (AAV). Men trots BRB permeabilitet AAV-partiklar injiceras intraokulärt hålla begränsas till den okulära utrymmet i denna modell. Våra resultat tyder på att genterapi för sjukdomar som visar genomsläpp BRB representerar inte ytterligare risk för systemiska biverkningar. Dessutom stöder de det faktum att andra hinder såsom ILM blir äventyras under näthinnesjukdom ge ökad tillgång till viruspartiklar. Våra resultat leder oss att tro att AAV kodning reportergener är ett utmärkt verktyg för att studera BRB permeabilitet och ILM integritet i djurmodeller av näthinnesjukdom. Särbundet, kan AAV varianten ShH10, som specifikt etiketter Müller Glia användas som ett verktyg för att märka retinal glia och rapportera om tillståndet i näthinnan som svar på sjukdom. ShH10 kommer att selektivt märka Müller Glia i både friska och sjuka näthinnor. Dock kommer både ShH10 och andra AAV ge effektivare gen leverans i näthinnor med komprometterade barriärer.
Några kritiska steg i att tillämpa de ovan beskrivna protokoll (1) utveckla fingerfärdighet för att utföra den säkraste intravitreal injektion och (2) korrekt fastställande av vävnaden före och efter dissekering. I studier retinala hinder bör intravitreal injektion vara välgjord som är - utan att röra linsen eller näthinnan. Skada linsen eller lossar näthinnan påverkar BRB permeabilitet 23,24. Dessutom linsskada hindrar fundus avbildning. Beröring näthinnan kan brista ILM och skada näthinnan strukturen. För att undvika att röra näthinnan, den experiMAnge bör observera spetsen på Hamilton-spruta i mitten av den vitrösa håligheten, framför näthinnan. Ett icke-toxiskt färgämne kan inkluderas (såsom fenol rött eller fluorescein) i den virala lösningen att hjälpa till vid observation av vätskeinjektion i glaskroppen. Skador på näthinnan kan lätt observeras under fundus avbildning efter injektionen förfarandet. En annan kritisk steg är fixeringen av vävnaden efter tillräckliga uttrycksnivåer uppnås. Efter enucleation måste ögonen omedelbart nedsänkt i fixativ buffert och innan vävnads permeabilization en andra fixering är nödvändigt för att förhindra GFP läckage. Det kan vara bra att springa hornhinnan innan nedsänkning hela ögat i fixativ - detta ger fixativet en chans att tränga in i glaskroppen. Detta steg kan öka den övergripande stabiliteten vävnaden.
Slutligen är det också viktigt att injicera tillräckligt AAV-partiklar för att omvandla ett effektivt näthinnan och att observera GFP expression på ögonbottenbilder. Den optimala mängden AAV-partiklar är omkring 10 10 -10 11 vg per öga, under 10 10 partiklar GFP uttryck är inte alltid observeras av fundus avbildning.
Denna teknik ger inte möjlighet att direkt observera ILM eller kärl nedanför BRB. Men det ger ett sätt att undersöka näthinnans hinder och att de ändras i sjukdomstillstånd, på ett sätt som tidigare inte var möjligt att använda Evans blue analysen och fluoresceinangiografi. Använda AAV med specifika retinal transduktion egenskaper, är det möjligt att få bättre inblick i tillståndet i näthinnan med avseende på de gliaceller, deras extracellulära matrix och ILM. Efter behärska denna teknik kan man testa effektiviteten av terapeutiska strategier och deras påverkan på BRB och retinal permeabilitet och gå till en bättre förståelse för sjukdomsprogression och möjligheten att återställa normala förhållanden efter behandling ina musmodell av näthinnesjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
