Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
Genexpressiestudies van neuronen onderscheiden in vitro van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) door ons 1 en anderen 2,3 geven aan dat iPSC neuronen lijken foetale eerder dan volwassen hersenweefsel. Momenteel kan iPSC-gebaseerde modellen geschikter voor de studie van aanleg voor, dan laat kenmerken van neurologische ziekte. We hebben eerder gemeld dat een aanzienlijke fractie van de genen profiel van schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen is geconserveerd in schizofrenie-iPSC afgeleide neurale progenitorcellen (NPC), wat aangeeft dat NPC nuttig celtype kan worden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die bijdragen tot schizofrenie 1 . Wij en anderen hebben afwijkende migratie, verhoogde oxidatieve stress en reactieve zuurstofverbindingen, gevoeligheid voor sub-threshold milieu stress en verminderde mitochondriale functie bij schizofrenie iPSC NPCs 1,4-6, evenals een verminderde neuronale c gemeldaansluitmogelijkheden en synaptische functie bij schizofrenie iPSC neuronen 5,7-10. Als de moleculaire factoren die bijdragen tot afwijkende migratie en / of oxidatieve stress bij schizofrenie iPSC NPC liggen ook aan de verminderde neuronale connectiviteit schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen kan NPC een robuust en zeer replicatieve neurale populatie waarmee de mechanismen verantwoordelijk voor de ziekte te bestuderen. Bovendien, omdat men snel kan genereren grote aantallen cellen en behoeft niet weken of maanden wachten neuronale rijping, NPC-gebaseerde assays zijn geschikt voor de studie van grotere patientencohorten en zijn meer vatbaar voor high throughput screening. Wij geloven dat iPSC NPC kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingspaden potentieel bijdragen aan pathogenese, zoals reeds aangetoond in diverse stoornissen schizofrenie 1 en Huntington's ziekte 11.
Om NPC's te onderscheiden van hiPSCs, eerste neurale inproductie wordt bereikt door het dual-SMAD inhibitie (0,1 mM LDN193189 en 10 mM SB431542) 12. Door antagoniseren van BMP en TGF signalering met deze kleine moleculen is endoderm en mesoderm specificatie geblokkeerd versnellen neuronale differentiatie en leidt tot de vorming van zichtbare neurale rozetten binnen een week van plating. Neurale patroonvorming optreedt vroeg in dit proces, vermoedelijk tijdens de neurale rozet vorming en onmiddellijk daarna. In afwezigheid van andere signalen, deze primitieve neurale cellen gaan uit van een anterieure voorhersenen-achtige lot 13. Onmiddellijk na neurale rozet vorming, en de lopende hele NPC expansie, voorhersenen NPC's zijn gekweekt met FGF2 8,14. Zij hebben een dubbele lijn potentieel en kan worden gedifferentieerd tot neurale populaties van 70-80% III-tubuline-positieve neuronen en 20-30% gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) -positieve astrocyten (figuur 1). De meeste voorhersenen iPSC neuronen VGLUT1 positieveEn dus zijn vermoedelijk glutamaat, hoewel ongeveer 30% van neuronen zijn GAD67-positief (GABAerge) 8.
NPC routinematig gepasseerd meer dan tien keer in vitro, met behoud differentiatie profielen zonder accumuleren karyotype afwijkingen. Groepen hebben passage NPCs meer dan 40 maal 15, vinden we echter dat voorbij tien passages, NPC's tonen verhoogde neiging tot astrocyten differentiatie gemeld. NPC goed verdragen meerdere vries-dooi en kan worden overgezet groeien als neurospheres door simpelweg kweken in niet-hechtende platen. NPC's worden efficiënt getransduceerd door virale vectoren, waardoor een snelle evaluatie van de moleculaire en cellulaire gevolgen van genetische verstoring, en eenvoudig uit te breiden om voldoende materiaal opleveren voor biochemische studies. Bovendien, omdat virale vectoren toe robuuste overexpressie en / of knockdown van ziekte-relevante genen in beide control of patiënt afgeleide NeurAl cellen, kan men dit platform gebruiken om het effect van genetische achtergrond van deze manipulaties testen. Hoewel niet geschikt voor synaptische of activity based assays die volwassen neuronen, kan NPC's een praktisch alternatief voor veel ongecompliceerd moleculaire of biochemische analyses van de patiënt afgeleide neurale cellen zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben beschreven methoden om te differentiëren hiPSCs in NPCs, een neuraal celtype waarin een aanzienlijk deel van het gen handtekening van iPSC-afgeleide neuronen wordt behouden en dat kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingstrajecten potentieel bijdragen aan de ziekte pathogenese 8, 11. Bovendien, zoals we hebben beschreven, NPC's zijn een robuust replicatief en gemakkelijk getransduceerde neurale bevolking, die naar onze mening kan geschikt zijn voor moleculaire en biochemische studies van d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington’s Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
