Una guida per generazione e l'uso hiPSC NPC derivati per lo Studio delle Malattie Neurologiche
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
Studi di espressione genica di neuroni differenziati in vitro da umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) da noi 1 e altri 2,3 indicano che i neuroni hiPSC assomigliano fetale piuttosto che adulti tessuto cerebrale. Allo stato attuale, i modelli basati hiPSC può essere più appropriato per lo studio della predisposizione, piuttosto che di fine 'di, malattia neurologica. Abbiamo precedentemente riportato che una frazione significativa della firma gene della schizofrenia neuroni hiPSC-derivati è conservata in celle schizofrenia hiPSC di derivazione progenitrici neurali (NPC), che indica che i PNG può essere un tipo di cellule utili per lo studio dei meccanismi molecolari che contribuiscono alla schizofrenia 1 . Noi e altri hanno segnalato la migrazione aberrante, aumento dello stress ossidativo e le specie reattive dell'ossigeno, la sensibilità al di sotto della soglia stress ambientali e alterata funzione mitocondriale nella schizofrenia hiPSC NPC 1,4-6, così come è diminuito neuronale connectivity e funzione sinaptica nei neuroni schizofrenia hiPSC 5,7-10. Se i fattori molecolari che contribuiscono alla migrazione aberranti e / o stress ossidativo nella schizofrenia hiPSC NPC alla base anche la connettività neuronale ridotta in schizofrenia neuroni hiPSC-derivati, PNG potrebbero essere una popolazione neurale robusto e altamente replicativa con cui studiare i meccanismi responsabili della malattia. Inoltre, perché si può rapidamente generare un gran numero di cellule e hanno bisogno di non aspettare settimane o mesi per la maturazione neuronale, test a base di NPC sono adatti per lo studio di coorti di pazienti più grandi e sono più suscettibili di screening ad alto rendimento. Crediamo che hiPSC NPC può servire come proxy per i percorsi di sviluppo potenzialmente contribuiscono alla patogenesi della malattia, come è già stato dimostrato in disturbi diversi come la schizofrenia 1 e Huntington della malattia 11.
Per differenziare NPC da hiPSCs, neurale inizialeproduzione si ottiene l'inibizione dual-SMAD (0,1 mM LDN193189 e 10mM SB431542) 12. Antagonizzando BMP e TGF segnalazione con queste piccole molecole, endoderma e mesoderma specifica è bloccato, accelerando la differenziazione neuronale e che porta alla formazione di rosette neurali visibili entro una settimana dalla placcatura. Patterning neurale si verifica all'inizio di questo processo, presumibilmente durante il periodo di formazione di rosette neurale e subito dopo. In assenza di altre indicazioni, queste cellule neurali primitive assumono una anterior proencefalo simile destino 13. Subito dopo la formazione di rosette neurale, e continua per tutta l'espansione NPC, NPC prosencefalo sono coltivate con FGF2 8,14. Hanno dual potenziale lignaggio e possono essere differenziati a popolazioni neurali del 70-80% neuroni III-TUBULINA-positivi e 20-30% proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) astrociti -positive (Figura 1). La maggior parte dei neuroni del prosencefalo hiPSC sono VGLUT1-positivi, E così sono presumibilmente glutamatergica, anche se circa il 30% dei neuroni sono GAD67-positivi (GABAergica) 8.
NPC sono regolarmente diversi passaggi più di dieci volte in vitro, pur mantenendo i profili di differenziazione coerenti, e senza accumulare anormalità del cariotipo. Gruppi hanno riportato PNG Passaging più di 40 volte 15, però, scopriamo che oltre dieci passaggi, PNG mostrano maggiore propensione per la differenziazione astrociti. NPC ben tollera più freeze-disgelo e può essere la transizione a crescere come neurosfere semplicemente coltura in piastre non aderenti. NPC sono efficacemente trasdotti da vettori virali, consentendo una rapida valutazione delle conseguenze molecolari e cellulari di perturbazioni genetiche, e facilmente espandibile per produrre materiale sufficiente per studi biochimici. Inoltre, poiché i vettori virali consentono robusto over-espressione e / o atterramento di geni-malattia rilevanti, sia di controllo o paziente derivato neurcellule di Al, si può utilizzare questa piattaforma per testare l'effetto di background genetico in queste manipolazioni. Anche se non è adatto per synaptic o saggi di attività a base richiedono neuroni maturi, PNG può essere una pratica alternativa per molte analisi molecolari o biochimici semplici di cellule neuronali derivate dal paziente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto i metodi con cui differenziare hiPSCs in PNG, un tipo di cellule neurali in cui una frazione significativa della firma genica dei neuroni hiPSC derivati si conserva e che possono servire come proxy per i percorsi di sviluppo potenzialmente contribuiscono alla patogenesi della malattia 8, 11. Inoltre, come abbiamo descritto, gli NPC sono una popolazione neuronale robusto replicativa e facilmente trasdotta, che riteniamo possa essere adatto per studi molecolari e biochimici di predisposi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
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