Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
Bizim 1 insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) in vitro farklılaşmış nöronların ve diğerleri 2,3 Gen ifadesi çalışmaları hiPSC nöronlar fetal ziyade yetişkin beyin dokusu benzer olduğunu göstermektedir. Şu anda, hiPSC-tabanlı modeller yerine geç özellikleri, nörolojik hastalığı dışında, yatkınlık çalışmaları için daha uygun olabilir. Daha önce NPC şizofreni 1 katkıda moleküler yolları araştırılmasında faydalı bir hücre tipi olabileceğini göstermektedir, şizofreni hiPSC türetilen nöron gen imza önemli bir kısmının şizofreni hiPSC türetilmiş sinir progenitör hücrelerinin (NPC) muhafaza edilir bildirmişlerdir . Biz ve diğerleri anormal göç, artmış oksidatif stres ve reaktif oksijen türleri, alt eşik çevresel streslere ve şizofrenide bozulmuş mitokondriyal fonksiyonu hiPSC NPC 1,4-6 hassasiyeti yanı sıra azalmış nöronal c bildirmiştironnectivity ve şizofreni hiPSC nöronlar 5,7-10 sinaptik fonksiyon. Şizofreni hiPSC NPC anormal göç ve / veya oksidatif strese katkıda moleküler faktörler de şizofreni hiPSC kaynaklı nöronlar azalmış nöronal bağlantı temelini ise, NPC hastalıktan sorumlu mekanizmaları incelemek için sağlam ve yüksek replikatif nöral nüfus olabilir. Bir hızla hücrelerin çok sayıda oluşturabilir ve nöronal olgunlaşması için hafta veya ay beklemek gerekmez, çünkü Ayrıca, NPC-tabanlı deneyler daha büyük hasta gruplarını çalışma için uygundur ve yüksek verimli tarama daha yatkındır. Biz zaten şizofreni 1 ve Huntington hastalığı 11 gibi farklı hastalıkların ortaya konmuştur olarak hiPSC NPC, potansiyel hastalık patogenezinde katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet verebilir inanıyoruz.
HiPSCs, ilk nöral gelen NPC ayırt etmektim çift SMAD inhibisyon (0.1 mM LDN193189 ve 10 mM SB431542) 12 tarafından gerçekleştirilir. Bu küçük moleküller ile sinyalizasyon BMP ve TGF antagonize ederek, endoderm ve mezoderm özellikleri nöronal farklılaşma hızlandırılması ve kaplama bir hafta içinde görünür nöral rozet oluşumuna yol açan, bloke edilir. Sinir desenlendirme muhtemelen hemen sonra nöral rozet oluşumu ve döneminde, erken bu süreçte oluşur. Diğer ipuçları yokluğunda, bu ilkel nöral hücreler anterior ön beyin-benzeri kaderi 13 varsayıyorum. Hemen nöral rozet oluşumu takip ve NPC genişleme boyunca devam eden, ön beyin NPC FGF2'nin 8,14 ile kültür. Onlar çift soy potansiyeline sahip ve% 70-80 III-tubulin-pozitif nöronlar ve% 20-30 glial fibriler asidik protein (GFAP) pozitif astrositler (Şekil 1) nöral nüfusa ayırt edilebilir. ön-beyin hiPSC nöronlarının çoğunluğu VGLUT1-pozitifNöronların yaklaşık% 30 GAD67 pozitif (GABA) rağmen ve böylece, muhtemelen glutamaterjik 8.
NPC rutin tutarlı farklılaşma profilleri muhafaza ve karyotip anomalileri biriken olmadan iken, in vitro fazla on kez geçişli. Gruplar Pasajlanması NPC'lerin 15, ancak, biz on pasajlar ötesinde, NPC astrosit farklılaşma eğilimini göstermektedir artmış olduğunu bulmak 40'tan fazla kez bildirilmiştir. NPC birden donma-çözülür iyi tolere ve sadece yapışmayan plakalarda kültürleme yoluyla neurospheres olarak büyümeye geçiş yapılabilir. NPC etkili bir biyokimyasal çalışmalar için yeterli malzeme elde etmek için hızlı bir genetik müdahalelerin moleküler ve hücresel sonucu değerlendirmeyi ve kolayca genişletilebilir sağlayan, viral vektörler tarafından iletilir. Ayrıca, çünkü viral vektörler izin sağlam aşırı ekspresyonu kontrolü veya hasta türetilmiş neur birinde ve / veya hastalık-ilgili genlerin demonte,El hücreleri, kimse bu manipülasyonlar genetik kökenli etkisini test etmek için bu platformu kullanabilirsiniz. Sinaptik veya olgun nöronlar gerektiren faaliyet tabanlı deneyleri için uygun olmasa da, NPC hasta kaynaklı sinir hücrelerinin çoğu basit moleküler veya biyokimyasal analizler için pratik bir alternatif olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz, NPC içine hiPSCs, bir sinir hücre tipi olan hiPSC türetilmiş nöronların gen imzası önemli bir kısmı korunur ve bu potansiyel hastalık patogenezinde 8 katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet edebilir ayırt etmek ile yöntemler tarif etmişlerdir 11. Biz detaylı gibi Ayrıca, NPC biz hastalık yatkınlık moleküler ve biyokimyasal çalışmalar için uygun olabilir inanıyoruz sağlam Replikatif ve kolayca transdük nöral nüfus vardır.
<p class="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington’s Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
