Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
Экспрессия генов исследований нейронов, дифференцированных в пробирке из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) нами 1 и других 2,3 показывают, что hiPSC нейроны напоминают плода, а не взрослых мозговой ткани. В настоящее время модели hiPSC основе может быть более подходящим для изучения предрасположенности к, а не конца особенностей, неврологические заболевания. Ранее мы уже сообщали, что значительная часть гена подписью шизофренией hiPSC полученных нейронов сохраняется у больных шизофренией hiPSC полученных нервных клеток-предшественников (НПС), указывая, что НПС может быть полезным типом клеток для изучения молекулярных путей, способствуя шизофрении 1 , Мы и другие сообщили, отклоняющееся миграции, повышение окислительного стресса и активных форм кислорода, чувствительность к югу от пороговых экологических стрессов и нарушения функции митохондрий при шизофрении hiPSC НПС 1,4-6, а также снижение нейронов Connectivity и синаптической функции у больных шизофренией hiPSC нейронов 5,7-10. Если молекулярные факторы, способствующие аномальным миграции и / или окислительного стресса у больных шизофренией hiPSC НПС также лежат в основе снижение нейронов подключения при шизофрении hiPSC полученных нейронов, НПС может быть надежной и высоко репликативной нейронной популяции, с которой для изучения механизмов, ответственных за болезни. Кроме того, поскольку можно быстро произвести большое количество клеток и не нужно ждать несколько недель или месяцев для созревания нейронов, анализы, основанные на NPC пригодны для изучения больших когорт пациентов и более пригодными для высокопроизводительного скрининга. Мы считаем, что hiPSC НПС может служить в качестве прокси для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания, как уже было показано, при расстройствах как разнообразны, как шизофрения 1 и Хантингтона болезни 11.
Чтобы дифференцировать NPC, с hiPSCs, начальной нервной вводства осуществляется двойным SMAD торможения (0,1 мМ LDN193189 и 10 мМ SB431542) 12. Конфликтуя BMP и TGF- сигналов с этих малых молекул, эндодермы и мезодермы спецификация их, ускоряя дифференцировку нейронов и приводит к образованию видимых нервных розетками в течение одной недели обшивки. Нейронные рисунка происходит в начале этого процесса, по-видимому в период нейронной розеткообразования и сразу же после этого. При отсутствии других сигналов, эти примитивные нервные клетки предположить переднюю переднего мозга, как судьба 13. Сразу же после образования нервной розетки, и продолжается в течение расширения NPC, переднего мозга НПС культивируют с FGF2 8,14. Они имеют двойное клонов потенциал и могут быть дифференцированы в нейронных популяций 70-80% III-ТУБУЛИН-положительных нейронов и 20-30% глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) -позитивных астроцитов (рис 1). Большинство переднего мозга hiPSC нейронов VGLUT1-положительных, И поэтому по-видимому глутаматергическая, хотя около 30% нейронов GAD67-положительных (ГАМК) 8.
НПС регулярно пассировать более чем в десять раз в пробирке, сохраняя последовательные профили дифференциации, и без накопления кариотипа нарушения. Группы сообщили пассажи НПС более чем в 40 раз 15, однако, мы находим, что за десять проходов, НПС показывают увеличение склонности к астроцитов дифференциации. НПС хорошо переносят многократные замораживания-оттаивания может быть перешли расти, как нейросферах просто культивирование в неприлипающих пластин. НПС эффективно трансдуцировали вирусными векторами, что позволяет быстро оценить молекулярных и клеточных последствий генетической возмущений и легко расширяется до получения достаточного количества материала для биохимических исследований. Кроме того, поскольку допускает вирусные векторы надежный чрезмерной экспрессии и / или нокдауна болезни отношение генов, в любом управления или пациента происходит NeurAl клетки, можно использовать эту платформу для тестирования эффекта генетического фона на этих манипуляций. Хотя это и не подходит для Synaptic или деятельности на основе анализов, требующих зрелых нейронов, НПС может быть практической альтернативой для многих простых молекулярных или биохимических анализов пациента, полученных нервных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали методы, с помощью которых дифференцировать hiPSCs в НПС, нейронная тип клеток, в которых значительная часть генов подписью hiPSC, полученных из нейронов сохраняется и может служить в качестве прокси-сервера для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания 8, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington’s Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
