بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل 1 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء 2-4.
Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني 5، وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral 6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا 8، هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids.
transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء.
تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية.
وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
