Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
L'epitelio intestinale è uno dei tessuti corporei più rapida proliferazione, che ha causato di attrarre grande interesse dalla ricerca sulle cellule tumorali e staminali. Nel 2009 una tecnica è stata pubblicata per generare culture durevoli di piccole cripte intestinali in matrigel, conservando una struttura dimensionale 3 1. Tali strutture, denominate organoidi intestinali, possono essere coltivate utilizzando tecniche standard, con circostante medio integrato con una serie di fattori di crescita definiti, compreso il BMP-segnalazione inibitore pathway zucca (Nog), il Wnt-via di segnalazione enhancer rspondin 1 (Rspo1) e fattore di crescita epidermico (EGF) tutto ha trovato per migliorare la proliferazione intestinale 2-4.
Organoidi superano linee tradizionali di cellule di cancro negli aspetti che sono non-mutato, hanno mantenuto la gerarchia di cellule staminali, mostrano la polarizzazione cellulare intatta e la differenziazione mostra in tutte le linee cellulari presenti nel piccolo int nascenteepitelio estinal. Dal momento che possono essere trasdotte per trasportare transgeni o RNA interference costruisce 5, vengono utilizzati per studiare elementi genetici specifici, compensa esperimenti con topi transgenici in aspetti di costo e di velocità. Espressione transgenica in organoidi può essere eseguita utilizzando retrovirale murino o vettori lentivirali 6,7. A causa delle limitazioni di retrovirus murini, in grado di trasduzione cellule mitotiche esclusivamente 8, trasduzione lentivirali viene più frequentemente utilizzata per le celle che sono difficili da infettare, come organoidi.
Viralmente trasdotte e esprimono stabilmente organoidi transgenici possono essere usati per una moltitudine di analisi a valle, tra cui RNA quantitativo analisi ed immunoistochimica. Nel loro insieme, la cultura di organoidi da cellule epiteliali intestinali primarie si è evoluto in una tecnica di routine che è facile da implementare, senza requisiti specifici di laboratorio, ed è diventato il romanzo standard cecultura ll nella ricerca sul epitelio intestinale.
Tecniche di trasduzione virale e successiva analisi a valle in organoidi sono noiosi da eseguire e per aiutare gli esperimenti organoide abbiamo generato questo protocollo video, che mostra i metodi per lentivirali trasduzione del organoidi coltivate. Mostriamo inoltre come la corretta elaborazione del organoidi può aumentare la resa e quindi migliorare le prestazioni di analisi a valle con tecniche di RNA o immunoistochimica. Nel protocollo, organoidi che sono derivati da piccole cripte intestinali sono stati usati esclusivamente, sebbene le tecniche descritte possono essere applicate a organoidi colon pure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo video corrente descrive trasduzione lentivirale di organoidi da epitelio intestinale primaria e l'analisi a valle di queste organoidi utilizzando tecniche RNA quantitative e immunoistochimica.
Trasduzione lentivirali è spesso eseguita in cellule aderenti o galleggianti in piastre di coltura. Poiché la struttura tridimensionale di organoidi li rende difficile da penetrare da particelle virali, sono utilizzati diversi metodi per aumentare l'efficacia. Pretrattamento di …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
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