Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
Das Darmepithel ist eine der am schnellsten vermehren Körpergewebe, die verursacht hat es großes Interesse aus der Forschung über Krebs und Stammzellen zu gewinnen. Im Jahr 2009 wurde eine Technik veröffentlicht, um lang anhaltende Kulturen von Klein Darmkrypten in Matrigel erzeugen, Erhaltung eine 3-dimensionale Struktur 1. Diese Strukturen, sogenannte Darm Organoiden, kann unter Verwendung von Standardtechniken gezüchtet werden, mit Umgebungsmedium mit einer Anzahl von definierten Wachstumsfaktoren, einschließlich BMP-Signalweg-Inhibitors Noggin (nOgh) ergänzt, die Wnt-Signalwegs Enhancer rspondin 1 (Rspo1) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) alle eine Darm Proliferation 2-4 verbessern.
Organoide übertreffen traditionelle Krebszelllinien in den Aspekten, dass sie nicht-mutierten sind, haben Stammzellen Hierarchie beibehalten, zeigen intakten Zellpolarisation und Ausstellungs Differenzierung in allen Zelllinien in der im Entstehen begriffenen kleine int gefundenestinal Epithel. Da sie transduziert Transgene tragen oder RNA-Interferenz-Konstrukte 5, werden sie verwendet, um spezifische genetische Elemente zu untersuchen, überwiegt Experimenten mit transgenen Mäusen in Facetten Kosten und Geschwindigkeit. Transgene Expression in Organoiden kann unter Verwendung von entweder murine retroviralen oder lentiviralen Vektoren 6,7 werden. Aufgrund der Einschränkungen der murine Retroviren, in der Lage zu transduzieren mitotischen Zellen ausschließlich 8 wird lentiviralen Transduktion häufiger für Zellen, die nur schwer zu infizieren, wie Organoiden verwendet.
Viral transduziert und stabil exprimierenden transgenen Organoiden kann für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden, einschließlich quantitative RNA-Analysen und Immunhistochemie. Zusammengenommen hat Kultur Organoide von primären intestinalen Epithelzellen in eine Routine-Technik, die einfach und ohne spezielle Laboranforderungen umzusetzen ist entwickelt, und hat sich die neue Norm in cell Kultur in Forschung auf das Darmepithel.
Techniken der virale Transduktion und nachfolgende Downstream-Analyse in Organoide sind mühsam durchzuführen und um organoide Experimente helfen wir generiert dieses Video-Protokoll und zeigt Methoden zur lentivirale Transduktion der kultivierten Organoide. Wir zeigen außerdem, wie die korrekte Verarbeitung Organoide kann die Ausbeute zu erhöhen und damit die Leistung zu verbessern nachgeschalteter Analyse mittels RNA-Techniken oder die Immunhistochemie. In dem Protokoll wurden Organoiden, die von kleinen Darmkrypten abgeleitet werden ausschließlich verwendet, obwohl die beschriebenen Techniken können zum Kolon Organoide als auch angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Video-Protokoll beschreibt lentivirale Transduktion Organoide von der Grund Darmepithel und nachgelagerten Analyse dieser Organoide mittels quantitativer RNA-Techniken und Immunhistochemie.
Lentivirale Transduktion wird oft in anhaftenden oder schwimmende Zellen in Kulturplatten durchgeführt. Da die dreidimensionale Struktur von Organoiden macht sie schwierig durch virale Partikel eindringen, sind eine Reihe von Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Vorbehandlung der …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
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