Ett protokoll för Lentiviral Transduction och Nedströms Analys av Intestinal Organoids
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
Tarmepitelet är en av de mest snabbväxande kroppens vävnader, vilket har orsakat det att locka breda intresse från forskning om cancer och stamceller. Under 2009 en teknik publicerades generera långvariga kulturer av små intestinala kryptor i matrigel, bevara en 3 dimensionell struktur 1. Dessa strukturer, som kallas tarm organoids, kan odlas med användning av standardtekniker, med omgivande medium kompletterat med ett antal definierade tillväxtfaktorer, inklusive BMP-signaleringsvägen hämmare noggin (Nog), Wnt-signaleringsvägen förstärkare rspondin 1 (Rspo1) och epidermal tillväxtfaktor (EGF) alla visat sig förbättra tarm proliferation 2-4.
Organoids träffa traditionella cancercellinjer i de aspekter som de är icke-muterade, har upprätthållit stamcells hierarki, visa intakta cell polarisering och uppvisar differentiering till alla cellinjer som finns i den framväxande små intestinal epitel. Eftersom de kan transduceras att bära transgener eller RNA interferens konstruerar 5, de används för att studera specifika genetiska element, uppväger experiment använder transgena möss i aspekter av kostnad och snabbhet. Transgen expression i organoids kan utföras med användning antingen murint retroviralt eller lentivirusvektorer 6,7. På grund av begränsningarna hos murina retrovirus, som kan transducera mitotiska celler uteslutande 8, är lentivirala transduktion oftare används för celler som är svåra att infektera, exempelvis organoids.
Viralt transducerade och stabilt uttrycker transgena organoids kan användas för en mängd analyser nedströms, inklusive kvantitativa RNA analyser och immunohistokemi. Sammantaget har kultur av organoids från primära intestinala epitelceller utvecklats till en rutin teknik som är enkel att implementera utan specifika laboratoriekrav, och har blivit den nya standarden i cell kultur i forskning om tarmepitelet.
Tekniker för viral transduktion och efterföljande nedströms analys organoids är tråkiga att utföra och för att underlätta organoid experiment vi genererade den här videon protokoll, som visar metoder för lentiviral transduktion av odlade organoids. Vi visar dessutom hur korrekt behandling av organoids kan öka avkastningen och därmed öka prestanda för nedströms analys använder RNA tekniker eller immunohistokemi. I protokollet, var organoids som härrör från små intestinala kryptor uteslutande används, även om de tekniker som beskrivs kan appliceras på kolon organoids också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella video protokollet beskriver lentiviral transduktion av organoids från primär tarmepitel och nedströms analys av dessa organoids med kvantitativa RNA tekniker och immunohistokemi.
Lentiviral transduktion utförs ofta i vidhäftande eller flytande celler i odlingsplattor. Eftersom tre-dimensionella strukturen hos organoids gör dem svåra att penetrera genom virala partiklar, är ett antal metoder för att öka effekten används. Förbehandling av organoids använder Chir99021 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
