Abstract
Die Fähigkeit, embryonalen Stammzellen der Maus zu differenzieren (ESC) zu neuralen Vorläuferzellen ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen, die neuronale Spezifikation sowie die Erzeugung von reifen neuralen Zelltypen für eine weitere Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Unterscheidung von ESC zu neuralen Vorläuferzellen mit Serum-freien, Monokultur. Das Verfahren ist skalierbar, effizient und führt zur Produktion von ~ 70% neuralen Vorläuferzellen innerhalb 4-6 Tagen haben. Es kann zu ESC aus verschiedenen Stämmen unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen angewendet werden. Neuralen Vorläuferzellen kann zugelassen werden, um weiter in funktionelle Neuronen und Glia differenzieren oder analysiert durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder molekularen Techniken. Der Differenzierungsprozess zugänglich ist Zeitraffermikroskopie und kann mit der Verwendung von Reporter-Linien, um die neuronale Spezifikationsprozess Überwachung kombiniert werden. Wir bieten Ihnen detaillierte Anweisungen, Medienaufbereitung und Zelldichte-Optimierung, damit der Prozess zu be angelegt, um die meisten ESC Leitungen und einer Vielzahl von Zellkulturgefäßen.
Introduction
Embryonale Stammzellen sind pluripotente Zellen des frühen Embryos mit der Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in vitro proliferieren, abgeleitet, während die Fähigkeit beibehalten wird (durch Bildung einer Chimäre) in alle adulten Zelltypen folgenden Wiedereinführung in einem geeigneten Stadium Embryos differenzieren, die Injektion in syngene oder immunsupprimierten (durch Bildung einer Teratom) oder in vitro unter Umständen von Cues 1. Die in vitro Differenzierung von embryonalen Maus-Stammzellen zu neuralen Linien wurde erstmals 1995 beschrieben und involviert die Bildung von vielzelligen Aufhängung Aggregate (Embryoid Bodies, EBs) in serumhaltigem Medium mit dem Morphogen Retinsäure 2-4 ergänzt. Seitdem wurde eine Vielzahl von Protokollen entwickelt, die neuronale Differenzierung 5 ermöglichen. Viele noch zu nutzen Aggregation, andere Co-Kultur mit Zelltypen induzieren und mehrere beinhalten die Verwendung von Serum-freien Medien. Alle Protokolle haben Vorteile einnd Nachteile und die genaue Art der neuronalen oder neuronalen Zellen produziert auch variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Protokoll.
Die ideale Protokoll wäre robust, skalierbar und nutzen vollständig definierten Medien und Substrate, sei zugänglich nicht-invasive Überwachung des Differenzierungsprozesses und führen zu der Erzeugung von reinen Populationen von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage, durch externe Signale und zur Differenzierung strukturiert werden in allen neuronalen und glialen Subtypen mit hoher Effizienz und Ausbeute in einer relativ kurzen Zeit. In den letzten zehn Jahren haben wir mit Hilfe wurde ein Verfahren zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen und Neuronen aus Maus ESC in einer niedrigen Dichte, Serum-freien anhaftenden Monolayer-Kultur 6-10. Dieses Protokoll erfüllt viele der oben genannten Kriterien: in unseren Händen die Effizienz der Differenzierung hat ganz konsequent über viele Jahre und eine Vielzahl von Zelllinien wurde, kann nach oben oder unten skaliert werden (wir erfolgreich Schiffe aus Platten mit 96 Vertiefungen zu 15 cm Durchmesser dishes) und die verwendeten Medien sind gut definiert. Das Verfahren ist offen für Zeitraffermikroskopie zur Überwachung der Differenzierung und einer Vielzahl von Strukturierungs Signale hinzugefügt werden, um die Erzeugung von verschiedenen Typen von neuronalen Subtypen (zB Shh und Fgf8 für dopaminerge Neuronen 6) zu induzieren.
Dennoch gibt es einige Probleme bezüglich der erfolgreichen Anwendung dieses Protokolls. Einer der wichtigsten Aspekte ist eine sorgfältige Vorbereitung der Medien. Wir bereiten immer die Medien im Haus trotz der Verfügbarkeit von kommerziellen Alternativen. Eine der verwendeten Ergänzungsmittel (N2; siehe Protocol) hat Änderungen gegenüber dem handelsüblichen Fassungen. Schließlich ist einer der wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens die optimale Zelldichte bei der Galvanisierung. Dies liegt hauptsächlich daran, während der autokrinen Natur eines der Induktion Signale (FGF4 11) erfordert, dass genügend Zellen vorhanden, um eine optimale viabil ermöglichen, sindkeit und Differenzierung, bei zu hohen Dichten Differenzierung (aufgrund autokrine Produktion von LIF 12 ggf. teilweise) beeinträchtigt. Es ist daher wichtig, dass die beiden Medienherstellung und Zell Plattierung sorgfältig durchgeführt und konstant, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.
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Protocol
1. Medien Vorbereitung
ANMERKUNG: Das Protokoll beruht auf der Verwendung einer Mischung aus zwei getrennten Medien: DMEM / F12 mit modifizierten N2 Ergänzung und Neurobasalmedium mit B27 Ergänzung ergänzt ergänzt, typischerweise in einem 1: 1 Verhältnis.
- Bereiten Sie die modifizierte N2 Ergänzung durch Vermischen der Komponenten in einem 15-ml-Tube. Nicht vortexen oder filtern diese; mischen durch Umdrehen des Röhrchens, bis die Lösung klar ist.
- Starten Sie durch Pipettieren von 7,2 ml DMEM / F12, dann fügen Sie 1 ml 25 mg / ml Insulin (in 0,01 M HCl hergestellt) und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Es dauert ein paar Minuten, bis die Lösung klar ist.
- 1 ml 100 mg / ml Apo-Transferrin (in Wasser), 33 ul 0,6 mg / ml progesternone (in Ethanol bildete), 100 ul 160 mg / ml (1 M) Putrescin (in Wasser bildete ), 10 ul 3 mM Natriumselenit (in Wasser) und 666 & mgr; l 7,5% Rinderserumalbumin und mischen das Felgenbett. Aliquot in 2,5 ml und bei -20 °C für bis zu 2 Monate.
- Bereiten Sie die Medien.
- Zu 250 ml DMEM / F12 hinzufügen 2,5 ml N2. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter.
- Zu 250 ml Neurobasal Medien 5 ml B27 Ergänzung. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter.
- Mischen Sie die Medien aus den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 in einem Verhältnis 1: 1. In einigen Fällen ist eine 1: 3-Mix erforderlich sein (ergänzt als 1: 1-Mischung in Schritt 1.2.4).
- Zu der Mischung hinzufügen 0,5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 0,2 mM) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 0,1 mM) und gut mischen ohne Schütteln. Lagern Sie das Material bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen und vermeiden, um Licht. Diese Endmischung wird als N2B27.
- Bereiten Sie die Gelatine-Lösung.
- Eine 1% ige Gelatinelösung in Reinstwasser und Autoklaven bei 121 ° C, 15 psi, 15 Min. Es ist wichtig, daß die Flasche für diese verwendet wird, ist vollständig frei von Reinigungsmittel oder Desinfektionsmittel, so empfiehlt es sich, dass eine neue Flasche istdafür verwendet und wird immer nur in Reinstwasser zwischen Gebrauch gespült. Aliquot der 1% igen Lösung in 50 ml-Teilmengen und halten bei 4 ° C für Monate.
- Erwärmen ein Aliquot von 1% Gelatine in einem 37 ° C warmen Wasserbad gelöst und in den 500 ml warmem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Gut mischen und pipettieren genug, um den Boden jeder Vertiefung oder Platte abzudecken. Ermöglichen die Gelatine, die Oberfläche für mindestens 30 min.
2. Ausplattieren der Zellen
Hinweis: Dieses Protokoll gilt auch für die Maus ESC in 10% Serum mit Leukämie (LIF), Serum-Ersatz mit LIF oder Serum-freien Medien mit LIF und bone morphogenetic protein 4 (BMP4) oder MEK und GSK3-Inhibitoren (2i Medien) gewachsen mit oder ohne LIF. Jedoch kann die Zeitsteuerung und die Effizienz der Differenzierung in Abhängigkeit von den Medien und Zellen (siehe Diskussion) variieren. Bei den hier gezeigten Experimenten verwendeten wir den 46C Maus ESC Linie (das hat eine EGFP Reporter klopfte in one der endogenen SOX1 Allele), in GMEM mit 10% Serum und LIF gewachsen. Für optimale Ergebnisse ist es wichtig, dass die Zellen dissoziiert und im N2B27 Medien erneut plattiert; einfaches Ändern von Medien aus GMEM / Serum / LIF zu N2B27 führt immer zu einem reduzierten Differenzierung Effizienz im Vergleich zu Neubelegung der Zellen.
- Wachsen die Zellen in GMEM mit 10% Serum, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten / ml LIF 13. Um einen subkonfluenten Kultur der Maus ESC, Platte erhalten Sie 1 x 10 6 Zellen in einen T25-Kulturflasche, die stattfinden wird 2 - 3 Werktagen.
- Beachten Zellen unter Hellfeld-Mikroskop. Wenn die Zellen subkonfluenten und bereit, Durchgang sind, spülen Sie sie zweimal in PBS. 1 ml der Zellabtrennungs Reagenz und zurück in den Inkubator für 2-5 min. Obwohl Trypsin und andere Enzyme können für Zelldissoziation verwendet werden, können sie eine negative Wirkung auf die Zellhaftung aufweisen, so dass die Beschichtungsdichten müssen sein adjusted.
- Sobald die Zellen beginnen, von der Platte zu heben, tippen Sie auf das Schiff, um sie in eine Einzelzellsuspension zu entfernen. Sammle die Zellen in eine Gesamtmenge von 10 ml Medium und Zelldissoziation Reagenz und Pipette in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Dreh die Zellen bei 300 g für 3 min bei RT.
- Vorsichtig den Überstand aspirieren und das Pellet in 10 ml vorgewärmtes N2B27 durch Auf- und Abpipettieren 3-5 mal. Beim Pipettieren der Suspension ab, Pipette gegen die Seite des Rohrs zu vermeiden, Blasen zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen, die mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer und Erfassung der Konzentration.
- Bereiten Sie eine Zellsuspension, die die gewünschte Anzahl an Zellen pro Volumeneinheit zu je Vertiefung in vorgewärmten N2B27 plattiert werden. Eine Dichte von 10.500 Zellen pro cm 2 in einer 6-Well-Platte (das heißt, 1 x 10 5 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte) ist optimal. Siehe Tabelle 1 für die vorgeschlagene Anzahl von Zellen pro cm 2 und plaTing Medienvolumina für eine Vielzahl von Zellkulturgefäßen.
- Saugen Sie das Gelatine aus dem Kulturgefäß und Platte der Zellsuspension nach dem vorgeschlagenen Dichte und Volumen in der Tabelle 1. Wirbeln Sie nicht die Platten, da dies die Zellen an der Mitte zu konzentrieren. Zeigen die Kulturen in einem feuchten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Ändern Sie alle Medien 1 - 2 Tage durch Ersetzen alle Medien mit frischen N2B27. Pipette vorsichtig wie Spülen der Zellen könnte Dichte beeinflussen und verringern Differenzierung Effizienz in den folgenden Tagen. Wo anfänglichen Lebensfähigkeit nach der Beschichtung schlecht ist, die Platte der Zellen in einem 1: 3-Mix der N2 und B27-Medien ergänzt und geändert werden, um diese N2B27 nach den ersten beiden Tagen. Zellen beginnen zu differenzieren und sollte SOX1 Ausdruck innerhalb von 4 (durch grüne Fluoreszenz des Reporters in der 46C-Zelllinie verwendet werden, hier nicht sichtbar) zeigen - 6 Tage.
3. Immunfluoreszenzfärbung
NEINTE: Das Protokoll kann auf jeden Schiffstyp angewandt werden. Das Volumen von jedem Reagenz pro Vertiefung von 6-Loch-Platte beschrieben und kann auf jede Oberfläche skaliert. Replattierung wird nicht aufgrund der geringen Rentabilität danach empfohlen.
- Entfernen Differenzierungsmedium und fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% (v / v) Paraformaldehyd, lassen für 15 Minuten.
- Waschen und Permeabilisierung der Zellen mit 2 ml PBS-T (phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,5% (v / v) Tween-20) zweimal. Zellen in PBS-T für bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
- Ersetzen PBS-T mit 1 ml PBS-T mit 10% (v / v) Serum (von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper). Inkubiere 1 Stunde auf der Platte Wippe bei RT keine unspezifische Bindung zu blockieren.
- Nach 1 Stunde, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS-T, und Inkubation in 500 ul Maus-IgG gegen βIII-Tubulin (verdünnt 1: 1000 in PBS-T mit 10% Serum). Setzen Sie auf dem Teller Wippe, und lassen Sie O / N bei 4 ° C.
- Von diesem Schritt immer schützen das Gefäßvon Licht. Mit PBS-T wasche die Zellen zweimal, dann fügen 500 ul fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (2 & mgr; g / ml in PBS-T mit 10% Serum, verdünnt). Legen Sie es auf dem Teller Wippe für 1 h bei RT.
- Mit PBS-T Spülen Sie die Zellen zweimal, dann fügen Sie 500 ul DAPI (0,5 ug / ml verdünnt in PBS-T) und lassen Sie für 5 min.
- Waschen Sie die Zellen erneut und halten sie in PBS-T. Zellen bereit sind, fotografiert zu werden und kann für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Beachten Sie, dass GFP-Signal verblasst im Laufe der Zeit, so ist es unangemessen, GFP Intensität der festen und lebende Zellen oder von Zellen zu unterschiedlichen Zeiten fixiert zu vergleichen.
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Representative Results
In diesem Experiment verwendeten wir den 46C-Zellinie 14, embryonalen Stammzellen der Maus mit einer endogenen SOX1-GFP-Reporter, um neuronale Differenzierung zu verfolgen. Durch die Nutzung dieser Zelllinie Expression von SOX1, ein Marker für neurale Vorläufer, kann durch grüne Fluoreszenz detektiert werden. Plattierungsdichte ist ein kritischer Faktor, um die neuronale Differenzierung zu erreichen. Embryonale Stammzellen der Maus wurden in 6-Well-Platte bei unterschiedlicher Dichte reicht von 10.500 bis 88.500 Zellen / cm 2 plattiert. 1A zeigt Differenzierung Effizienzen von verschiedenen Beschichtungsdichten in einer 6-Well-Platte erreicht. Am 6. Tag der Differenzierung wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und für die neuronalen Marker βIII -Tubulin gefärbt. Bei der optimalen Dichte (10.500 Zellen / cm 2), Zellen zu neuralen Vorläuferzellen und Neuronen differenziert. Dies wurde durch das grün fluoreszierende Signal von SOX1-GFP-Reporter und Immunfluoreszenz gegen die neuronalen Marker, βIII-Tubulin beobachtet. A lower Plattierungsdichte führte zu Zelltod innerhalb von 3 Tagen. Jedoch Plattieren bei einer zu hohen Dichte (> 36.500 Zellen / cm 2) führte zu einer verringerten Anteil an Grünzellen und βIII-Tubulin-positive Zellen. 1B zeigt ein Experiment in einem 96-Well-Platte, die etwa 10-mal höhere Zelldichte erforderlich geführt erreichen die optimale (155.000 Zellen / cm 2) und die zu konfluenten (362.500 Zellen / cm 2) Ebene.
Optimale Dichte unterschiedlich zwischen Medien Vorbereitungen Medienkomponente und Zellchargen, Zelltypen oder früheren Kulturbedingungen sein. Es wird empfohlen, Plattierungsdichte für jedes Experiment zu optimieren. In Tabelle 1 sind Bereiche der wirksamen Beschichtung Dichten in verschiedenen Plattformen, die in der Optimierungsschritt enthalten sein sollten. Innerhalb dieses Bereichs sollte es möglich sein, eine Dichte, die eine gute Differenzierung Effizienz innerhalb 4 gibt zu bekommen - 6 Tage.
Während der Differenzierung ESC nach und nach ihre Morphologie verändern. Abbildung 2 zeigt Zelle und Koloniemorphologie von Tag 1 bis Tag 6 nach der Plattierung in 6-Well-Platte bei 10.500 Zellen / cm 2. Die Zellen wurden in Differenzierungsbedingungen kultiviert und fotografiert jeden Tag. Es ist nicht ungewöhnlich zu signifikanten Zelltod in den ersten paar Tagen aufgrund extremer Änderung der Kulturbedingung. Jedoch sind die verbleibenden Zellen noch in der Lage zu unterscheiden. Am Tag 4 begann Zellen zu neuralen Vorläuferzellen, wie grün fluoreszierende Signal von SOX1-GFP-Reporter zuerst erschienen zu werden. Aber auch am Tag 6, nicht alle Zellen SOX1-positiv. Existenz einiger nicht-neuronalen Zellen zu erwarten ist, die jedoch in einem geeigneten Bedingungen die Mehrheit der Zellen neuralen sein.
Abbildung 1. Die Wirkung von Beschichtungs-Dichte auf Differenzierung Effizienz. Zwei verschiedeneDichten SOX1-GFP-Reporterzellen (46C) wurden gemäß dem Protokoll für 6 Tage ausplattiert und differenziert. (A) Die Differenzierung in einer 6-Well-Platte. (B) Die Differenzierung in einer 96-Well-Platte. Maßstab:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Zellmorphologie während des Differenzierungsprozesses. 46C ESC wurden bei 10.500 Zellen pro cm 2 in einer 6-Well-Kulturplatte differenziert und tägliche fotografiert, um Veränderungen der Zellmorphologie zu beobachten. Maßstab:. 300 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Plattform | Bereich von effektiven Dichte (Zellen / cm 2) | Bereich von Zellzahl auf den Teller | Empfohlene Anfangs Medien Volumen (ul) | Empfohlenes Medienvolumen für Tag 1 (ul) |
| 6-Well-Platte | 10.500 - 36.500 | 99750 - 346750 | 1000 | 2.000 |
| 24-Well-Platte | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1000 |
| Platte mit 96 Vertiefungen | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |
Tabelle 1. Empfohlene Plattierung Dichten und Medienvolumen für verschiedene Gefäßgrößen. Die Beschichtungsdichten in dieser Tabelle wurden mit dem 46C-Zelllinie bestimmt. Für optimale Ergebnisse die Beschichtungs-Dichte jeder einzelnen Linie müssen möglicherweise adj werdenusted.
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Discussion
Die Monoschicht neuronalen Differenzierung Protokoll wird seit mehr als einem Jahrzehnt 6 gewesen. Das Protokoll ist sehr leistungsfähig, von definiertem Medium zusammengesetzt ist und in einer Monoschicht-System, das das System eher für präklinische macht gemacht (zB Arzneimittel-Screening) verwendet. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die die Differenzierung Effizienz zu bestimmen. Dieser Artikel weist darauf hin, die Faktoren und die Lösung für jedes Hindernis.
Dichte der Zellen nach der Plattierung in der Differenzierung Bedingung ist möglicherweise der kritischste Faktor. Ausplattieren der Zellen bei einer zu hohen Dichte verringert Differenzierung Effizienz, während Plattieren bei einer zu niedrigen Dichte zum Zelltod führt. Dieses Phänomen ist darauf zurückzuführen, autokriner Wachstumsfaktor Signalisierungs wahrscheinlich. FGF4 ist ein autokriner Wachstumsfaktor, der MAPK-Kaskade aktiviert und treibt ESC Differenzierung 11. LIF ist ein weiterer von ESC produzierte Zytokin. Es aktiviert die STAT3-Weg und fördert die Selbsterneuerung <sup> 15. Dieses Protokoll nutzt N2B27 Nervenzellen zu bilden. N2B27 enthält verschiedene Faktoren, die das Überleben zu ermöglichen ESC und fördert neuronalen Zellwachstum, und weder LIF oder BMP4, die neuronale Differenzierung 6 inhibieren. In der richtigen Dichte wird ein geeignetes Gleichgewicht der FGF4 und LIF-Signalisierung gehalten, die ESC zur Differenzierung ermöglicht. Mit hoher Dichte, überschüssige Menge an autokrinen LIF und BMP Sperre Differenzierung. Im Gegensatz dazu wurden die Zellen mit einer zu niedrigen Dichte Überleben bei diesen relativ minimalem Medium beeinträchtigt. Somit wird, wenn eine große Zahl von Zellen, die ohne Unterscheidung erscheinen die Plattierung Anzahl verringert werden sollte, während eine Erhöhung der Galvanisierzelle Nummer erforderlich ist, wenn erhebliche Zelltod beobachtet.
Zusätzlich zu der Zellzahl gibt es einige andere Faktoren, die indirekt auf die Dichte der Schicht. Der erste Faktor ist die lokale Zellkonzentration in Abhängigkeit von der Technik, die zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen über die OberflächeBereich. Wir fanden, dass die wirbelnden und ist nicht ideal, da sie die Zellen konzentriert zu der Mitte der Vertiefung und macht die Dichte im Zentrum zu hoch ist, während an der Peripherie die Dichte zu niedrig wird. Andere Mischtechniken, beispielsweise durch Mischen der Medien mit den Zellen vor dem Plattieren oder Schaukeln der Platte von Seite zu Seite zu empfehlen. Außerdem, wenn ein Behälter in den Inkubator gestellt, ungleichmäßige Erwärmung des Mediums bewirkt eine Konvektion Kraft, die die Zellen an der Mitte der Vertiefung zieht, was zu einer Verteilung der Zellen in einem konzentrischen Ringmuster. Eine niedrigere Mediavolumen auf der Plattierung Tag wird empfohlen, um diesen Effekt zu reduzieren. Verlassen der Platte außerhalb des Inkubators für 30 Minuten, damit sich die Zellen zu befestigen, sowie Erwärmung des Mediums vor dem Mischen kann auch dazu beitragen, ein homogenes Beschichtungs-Dichte.
Zum anderen wirkt sich der Schiffstyp auch Plattierungsdichte. Abbildung 1 zeigt deutlich, dass die Anzahl der Zellen / nicht linear sein scaführte zu der Oberfläche von verschiedenen Gefäßen (mit anderen Worten kann die gleiche Anzahl von Zellen / Fläche nicht für jeden Behälter-Typ angewendet werden.) Eine kleinere Behälter (mit größerem Volumen / Fläche-Verhältnis) mehr durch den Medienoberflächenspannung, die eine konkave Oberfläche des Mediums, der sogenannten Meniskus macht betroffen. Die Oberflächenspannung drückt die Zellen an den Rand der Vertiefung und verringert Dichte in der Mitte. Darüber hinaus, da Mediavolumen in dem kleinen Behälter niedrig, Medien Aufwärmen schnell, die Verringerung der Konvektion Kraft. Daher werden die Zellen in einem kleinen Gefäß an den Rand des Meniskus Effekt zu bewegen, und wird nicht in die Mitte zu bewegen durch Konvektion Kräfte. Je kleiner also der Behälter, desto höher die erforderlich ist, um die optimale Dichte in der Mitte erhalten Plattierungsdichte.
Drittens vor dem Beschichten beeinflusst der Zustand der Zellen indirekt Plattierungsdichte und Differenzierung Effizienz. Wir fanden eine Variation der optimale Dichte in einigen Experimenten. Die Experimente mithöhere Sterblichkeitsrate am ersten Tag benötigt höhere Dichte für effiziente Differenzierung. ESC Kulturen im Serum und LIF sind aus einer heterogenen Population von pluripotenten Zellen naive, grundiert pluripotenten Zellen und sogar einer kleinen Anzahl von differenzierten Zellen 16 zusammengesetzt ist. Zellen dieser Arten haben unterschiedliche Fähigkeit, zu überleben und zu differenzieren unter Differenzierungsbedingungen. Da das Protokoll vorschreibt auf der Zahl, aber nicht der Zustand der Zellen, möglicherweise einige Experimente mit differenzierter Zellen, die auf die ersten paar Tagen sterben beginnen, was zu einer geringeren Dichte als erwartet. Um diese Variation zu vermeiden, wird konsequent Kultur ESC erforderlich, um sicherzustellen, dass der konstante Anteil zwischen jedem Zustand wird beibehalten.
Abgesehen von Dichte, Timing ist ein weiterer Faktor, um eine effiziente Differenzierung zu erreichen. In dieser Veröffentlichung beschreiben wir die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen innerhalb von 6 Tagen. Jedoch kann die Zeit unterschiedlich sein, je nach dem Zustand derdie Start ESC Kultur. Wie oben beschrieben, ESC Kulturen Mischpopulationen, die unterschiedlich zu der Differenzierungszustand reagieren. Nicht nur das Überleben der Zelle, sondern auch der Zeitpunkt der Differenzierung durch die Kultur Zusammensetzung beeinflusst werden. Dieses Protokoll kann auf die meisten ESC Kulturbedingungen Beispiel angewendet werden, in Medien, die N2B27 LIF und BMP4 oder 2i und LIF. Jedoch, wenn es mehr naiven Zellen in der Kultur, eine längere Periode kann für eine effiziente Differenzierung erforderlich. Dies liegt daran, naive Zellen wird mehr Zeit brauchen, um auf eine grundierte Zustand zu schalten und dann in neuralen Vorläuferzellen zu differenzieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
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