Een Trombotische Stroke model op basis van Transient Cerebrale hypoxie-ischemie
Summary
Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.
Abstract
Stroke onderzoek heeft vele tegenslagen doorstaan in het vertalen van neuroprotectieve therapieën in de klinische praktijk. In tegenstelling, de echte therapie (tPA trombolyse) produceert nauwelijks voordelen mechanische occlusie gebaseerde experimentele modellen die preklinisch onderzoek beroerte domineren. Deze splitsing tussen de bank en bed suggereert de noodzaak om tPA-responsieve modellen in dienst in preklinische beroerte onderzoek. Hiertoe wordt een eenvoudige en tPA-reactieve trombotische slagmodel uitgevonden en hierin beschreven. Dit model bestaat uit transiënte occlusie van de eenzijdige halsslagader en levering van 7,5% zuurstof via een gezichtsmasker bij volwassen muizen gedurende 30 min, terwijl de rectale temperatuur dier op 37,5 ± 0,5 ° C. Hoewel reversibele ligatie van de eenzijdige halsslagader of hypoxie elke onderdrukte hersenbloedstroom alleen transiënt, de combinatie van beide beledigingen heeft langdurige reperfusie stoornissen, fibrine en bloedplaatjes afzetting en grote infarct in het midden cerebrale slagader geleverd grondgebied. Belangrijk-staartader injectie van recombinant tPA op 0,5, 1, of 4 uur na Thi (10 mg / kg) die tijdsafhankelijke vermindering van de sterfte en de infarctgrootte. Dit nieuwe slagmodel is eenvoudig en kan worden gestandaardiseerd laboratoria experimentele resultaten te vergelijken. Verder induceert trombose zonder craniectomy of invoering voorgevormde embolie. Gezien deze unieke verdiensten, de THI-model is een nuttige aanvulling op het repertoire van preklinisch beroerte onderzoek.
Introduction
Trombolyse recanalization is de meest effectieve behandeling van acute ischemische beroerte in de klinische praktijk 1. Maar de meeste preklinische neuroprotectie onderzoek werd uitgevoerd in een tijdelijke mechanische obstructie model (intraluminale hechtdraad middelste cerebrale arterie occlusie) dat snelle herstel van de cerebrale bloedstroom bij verwijdering van de vasculaire occlusie produceert en vertoont weinig of geen voordelen met tPA trombolyse. Er is gesuggereerd dat de twijfelachtige keuze takt modellen droegen, ten minste gedeeltelijk, de moeilijkheid bij het vertalen neuroprotectieve therapie bij patiënten 2,3. Daarom is er een toenemende roep om het gebruik van tPA-responsieve trombo-embolische beroerte modellen in preklinisch onderzoek, maar dergelijke modellen hebben ook technische problemen (zie Discussie) 4-7. Hier beschrijven we een nieuw trombotische beroerte model gebaseerd op eenzijdige voorbijgaande hypoxie-ischemie (THI) belediging en haar antwoorden op intraveneuze tPA therapie 8.
De THI beroerte model werd ontwikkeld op basis van de Levine procedure (permanente ligatie van de eenzijdige gemeenschappelijke halsslagader, gevolgd door blootstelling aan voorbijgaande hypoxie in een kamer), die werd uitgevonden voor experimenten met volwassen ratten in 1960 9. De oorspronkelijke Levine procedure vervaagde in de vergetelheid, omdat alleen produceerde variabele hersenschade, maar dezelfde insult veroorzaakt consistente neuropathologie knaagdieren pups toen het werd opnieuw geïntroduceerd door Robert Vannucci en zijn collega's als een model van neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE) in 1981 10. In de afgelopen jaren zijn sommige onderzoekers opnieuw aangepast de Levine-Vannucci model volwassen muizen door het aanpassen van de temperatuur van de hypoxische kamer 11. Het is aannemelijk dat de inconsistente hersenletsels in het oorspronkelijke Levine kunnen opkomen van wisselende lichaamstemperaturen van volwassen knaagdieren in de hypoxische kamer. Om deze hypothese te testen, hebben we de Levine procedure gewijzigd door het toedienen van hypoxische gasvia een gezichtsmasker, terwijl de knaagdieren kerntemperatuur bij 37 ° C op de operatietafel 12. Zoals verwacht stringente lichaamstemperatuur sterk toegenomen reproduceerbaarheid van HI-geïnduceerde hersenpathologie. De HI belediging triggers ook coagulatie, autofagie en grijs- en witte stof letsel 13. Andere onderzoekers hebben ook gebruik van de HI model om na een beroerte ontstekingsreacties 14 onderzoeken.
Een uniek kenmerk van de HI slagmodel is dat volgt de Virchow triade van trombusvorming, waaronder de stasis van de bloedstroom, endotheliale schade (bijvoorbeeld door HI-geïnduceerde oxidatieve stress) en hypercoagulabiliteit (HI-geïnduceerde bloedplaatjesactivering) ( Figuur 1A) 15. Als zodanig kan de HI model sommige pathofysiologische mechanismen om real-world herseninfarct relevant vast te leggen. Met dit idee in het achterhoofd, hebben we verder verfijnd de HI model met omkeerbare ligatie van de VNilateral carotis communis (dus een voorbijgaande HI insult te maken), en getest zijn reacties op tPA trombolyse met of zonder Edaravone. Edaravone is een vrije radicalen die al in Japan goedgekeurd voor ischemische beroerte binnen 24 uur na het begin 9 behandelen. Onze experimenten toonden aan dat zo kort 30 min voorbijgaande HI triggers trombotische infarct, en dat gecombineerd tPA-Edaravone behandeling verleent synergetische 8 voordelen. Hier beschrijven we gedetailleerde chirurgische procedures en methodologische overwegingen van het THI-model, dat gebruikt kan worden om reperfusie behandeling van acute ischemische beroerte optimaliseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beroerte is een belangrijk gezondheidsprobleem van groeiende betekenis voor elke samenleving met een vergrijzende bevolking. Wereldwijd, een beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak met een geschatte 5,9 miljoen fatale gebeurtenissen in 2010, wat overeenkomt met 11,1% van alle sterfgevallen 18. Stroke is ook de derde belangrijke oorzaak van disability adjusted life years (DALY's) verloren wereldwijd in 2010, een stijging van de vijfde positie in 1990 19. Deze epidemiologische gegevens o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.
Materials
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~13 weeks old (22~30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in-vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in-vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in-vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-braina imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research–advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3. r. d., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow’s triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed–specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
