Тромботическая хода модели, основанной на переходных гипоксии мозга-ишемии
Summary
Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.
Abstract
Ход исследования пережил множество неудач в переводе нейропротекторные терапии в клинической практике. В отличие от реального мира терапия (тромболизис ТАП) редко производит преимущества в механических окклюзии на основе экспериментальных моделей, которые доминируют доклинические исследования хода. Этот раскол между скамейке и кровати предполагает необходимость использования ТАП отзывчивые модели в доклинических исследований инсульта. С этой целью, простой и ТРА-реактивного тромботической модели инсульта изобретен и описано здесь. Эта модель состоит из переходного окклюзии одностороннего общей сонной артерии и доставки 7,5% кислорода через лицевую маску у взрослых мышей в течение 30 мин, при поддержании температуры ректальное животных на 37,5 ± 0,5 ° C. Несмотря на то, обратимо лигирование сонной артерии одностороннего или гипоксии друг подавляется мозговое кровообращение лишь временно, сочетание обоих инсультов вызваны дефицитом прочного реперфузии фибрин и отложение тромбоцитов и большой infarКТ на территории средней мозговой артерии, в комплект поставки. Важно отметить, что в хвостовую вену рекомбинантного ТАП в 0,5, 1 или 4 ч после Тхи (10 мг / кг), при условии, зависящих от времени снижение уровня смертности и инфаркта размера. Эта новая модель хода проста и может быть стандартизированы по лабораториям сравнивать экспериментальные результаты. Кроме того, он вызывает тромбоз без удаление фрагментов костей черепа или введения предварительно сформированный эмболии. Учитывая эти уникальные достоинства, модель Тхи является полезным дополнением к репертуару доклинических исследований инсульта.
Introduction
Тромболизис и реканализация наиболее эффективная терапия острого ишемического инсульта в клинической практике 1. Тем не менее, большинство доклинических исследований нейропротекции была выполнена в переходном механической модели обструкции (внутрипросветного шов окклюзии средней мозговой артерии), который производит быстрое восстановление мозгового кровотока после снятия окклюзии сосудов и показывает практически нет преимущества, ТАП тромболизиса. Было высказано предположение, что сомнительно выбор моделей инсульта способствовало, по крайней мере частично, с трудностью в переводе нейропротекторное терапии для пациентов 2,3. Следовательно, есть увеличение вызов для трудоустройства ТАП отзывчивые модели тромбоэмболических инсульта в доклинических исследований, но такие модели также есть технические проблемы (см Обсуждение) 4-7. Здесь мы опишем новую модель тромбо инсульта на основе одностороннего переходного гипоксически-ишемическая (Тхи) оскорбление и его ответов на внутривенное ТАП терапии 8.
Модель Тхи ход был разработан на основе процедуры Levine (постоянное лигирования одностороннего общей сонной артерии с последующим воздействием на переходном гипоксии в камере), который был изобретен для экспериментов со взрослыми крысами в 1960 году 9. Первоначальная процедура Левин канули в безвестность, потому что это производится только переменную повреждение головного мозга, но то же самое оскорбление вызвало последовательное невропатологии грызунов щенков, когда он был вновь введен Робертом Vannucci и его коллегами в модели новорожденных гипоксически-ишемической энцефалопатии (HIE) в 1981 году 10. В последние годы, некоторые Исследователи повторно адаптированы модели Левина-Vannucci взрослым мышам путем регулирования температуры в гипоксической камере 11. Вполне вероятно, что противоречивые поражения головного мозга в оригинальной методике Левина может возникнуть от колебаний температуры тела взрослых грызунов в гипоксической камере. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изменили процедуру Левин путем введения гипоксического газачерез маску, при сохранении внутренней температуры грызунов при 37 ° С на операционном столе 12. Как и ожидалось, контроль температуры тела жесткими значительно увеличилось воспроизводимость HI-индуцированной патологии головного мозга. HI оскорбление также вызывает коагуляцию, аутофагии, и серо и белого вещества травмы 13. Другие исследователи также использовали модель HI, чтобы исследовать после инсульта воспалительные реакции 14.
Уникальной особенностью модели HI инсульта является то, что внимательно следит триаде Вирхова образования тромбов, в том числе застой кровотока, повреждения эндотелия (например, вследствие HI-индуцированного окислительного стресса), и гиперкоагуляции (активации тромбоцитов HI-индуцированной) ( 1А) 15. Таким образом, модель HI может захватить некоторые патофизиологические механизмы, имеющие отношение к реальной ишемического инсульта. С этой идеей в виду, мы далее уточнили модель HI с реверсивным перевязки ООНilateral общей сонной артерии (поэтому, чтобы создать переходный HI оскорбление), и проходят его ответов на ТАП тромболизиса с или без Edaravone. Edaravone является свободных радикалов уже одобрен в Японии для лечения ишемического инсульта в течение 24 часов в начале 9. Наши эксперименты показали, что, как краткое, как 30 мин переходный HI вызывает тромботические миокарда, и что комбинированное лечение ТАП Edaravone дает синергический эффект 8. Здесь мы описываем подробные хирургических процедур и методологические аспекты модели Thi, которые могут быть использованы для оптимизации реперфузии лечения острого ишемического инсульта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Инсульт является основной проблемой здоровья растет значение для любого общества с старение населения. В глобальном масштабе, инсульт является второй ведущей причиной смерти оценкам 5,9 млн роковых событий в 2010 году, что эквивалентно 11,1% всех случаев смерти 18. Инсульт также треть?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.
Materials
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~13 weeks old (22~30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in-vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in-vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in-vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-braina imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research–advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3. r. d., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow’s triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed–specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
