דגם שבץ טרומבוטיים בהתבסס על היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת
Summary
Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.
Abstract
מחקר שבץ סבל עיכובים רבים בתרגום טיפולי נוירו לתוך פרקטיקה קלינית. לעומת זאת, הטיפול בעולם האמיתי (thrombolysis tPA) לעתים רחוקות מייצר יתרונות בדגמים ניסיוניים המבוסס על חסימה מכאני, אשר שולטים מחקר פרה-קליני שבץ. פיצול זה בין הספסל והמיטה מרמז על הצורך להעסיק דגמי tPA מגיבים במחקר פרה-קליני שבץ. לשם כך, מודל שבץ טרומבוטיים פשוט וtPA-reactive הוא המציא ושתואר כאן. מודל זה מורכב מחסימה הזמנית של עורק תרדמה המשותף חד-צדדי ואספקה של חמצן 7.5% באמצעות מסכת פנים בעכברים בוגרים למשך 30 דקות, תוך שמירה על הטמפרטורה רקטלית של בעלי החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. למרות קשירה הפיכה של עורק תרדמה חד-צדדי או היפוקסיה כל מודחקת זרימת דם במוח רק זמני, השילוב של שניהם העלבונות שנגרם נמשך גירעונות reperfusion, הפיברין ותצהיר של טסיות דם, וinfar הגדולct בשטח המסופק עורק המוח האמצעי. חשוב לציין, הזרקה של רקומביננטי tPA ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות שלאחר תי (10 מ"ג / קילוגרם) וריד זנב סיפק הפחתה של גודל שיעור תמותה ואוטם תלוי זמן. מודל השבץ חדש זו הוא פשוט ויכול להיות טופל בכל מעבדות להשוות את תוצאות ניסוי. יתר על כן, זה גורם פקקת ללא craniectomy או החדרת תסחיפים מראש יצר. בהתחשב ביתרונות הייחודיים אלה, מודל תי הוא תוספת שימושית לרפרטואר של מחקר פרה-קליני שבץ.
Introduction
Thrombolysis וrecanalization הוא הטיפול היעיל ביותר של שבץ איסכמי חריף בפרקטיקה קלינית 1. ובכל זאת, רוב המחקר פרה-קליני neuroprotection בוצע במודל חולף מכונאי חסימה (חסימת intraluminal תפר האמצע מוחית עורק) שמייצר התאוששות מהירה של זרימת דם במוח על הסרת החסימה של כלי הדם ומראה לא מעט על מנת יתרונות על ידי thrombolysis tPA. זה כבר הציע כי הבחירה המפוקפקת של דגמי שבץ תרמה, לפחות בהחלק, לקושי בתרגום טיפול נוירו לחולי 2,3. לפיכך, יש שיחת הגדלת להעסקת דגמי שבץ תרומבואמבוליים tPA מגיבים במחקר פרה-קליני, אך מודלים כאלה צריכים גם בעיות טכניות (ראה דיון) 4-7. כאן אנו מתארים מודל שבץ טרומבוטיים חדש המבוסס על עלבון חד צדדי חולף חוסר חמצן-איסכמי (תי) והתגובות שלה לטיפול tPA לוריד 8.
מודל שבץ תי פותח על בסיס הליך לוין (קשירת קבע של עורק תרדמה משותפת חד-צדדי ואחרי חשיפה להיפוקסיה החולפת בתא) שהומצא לניסויים בחולדות מבוגרות בשנת 1960 9. הליך לוין המקורי דהוי לתוך החושך כי זה רק מיוצר נזק מוחי משתנה, אבל באותו העלבון שנגרם נוירופתולוגיה עקבית בגורי מכרסמים כאשר הוא מחדש הוצג על ידי רוברט ואנוצ'י ועמיתיו כמודל של אנצפלופתיה חוסר חמצן-איסכמי בילוד (hie) בשינה 1981 10. בשנים האחרונות, כמה חוקרים מחדש מותאמים מודל לוין-אנוצ'י לעכברים בוגרים על ידי התאמת הטמפרטורה בתא חוסר חמצן 11. זה מתקבל על הדעת שהנגעים במוח עולים בקנה אחד בהליך לוין המקורי יכולים לנבוע מתנודות טמפרטורות גוף של מכרסמים מבוגרים בחדר חוסר חמצן. כדי לבדוק השערה זו, שינינו את הליך לוין ידי מתן גז חוסר חמצןדרך facemask, תוך שמירה על טמפרטורת הליבה של מכרסמים על 37 מעלות צלזיוס על השולחן כירורגית 12. כצפוי, בקרת טמפרטורת גוף מחמיר גדלה מאוד את שחזור של פתולוגיה המוח הנגרם על-HI. עלבון HI גם מפעיל קרישה, autophagy, ואפורה ולבן-עניין פציעה 13. גם חוקרים אחרים השתמשו במודל HI לחקור תגובות דלקתיות פעימות הודעה 14.
תכונה ייחודית של מודל שבץ HI היא שזה כדלקמן השלישייה של Virchow של היווצרות קריש דם, כוללים הקיפאון של זרימת דם, פגיעת אנדותל (למשל עקב סטרס חמצוני המושרה HI), וhypercoagulability (הפעלת טסיות דם הנגרם על-HI) (בשיתוף פעולה הדוק איור 1 א) 15. ככזה, מודל HI יכול ללכוד כמה מנגנוני pathophysiological רלוונטיים לשבץ איסכמי בעולם האמיתי. עם הרעיון הזה בראש, אנחנו נוספים מעודנים מודל HI עם קשירה הפיכה של האו"םעורק תרדמה משותף ilateral (ולכן כדי ליצור עלבון HI חולף), ונבדק תגובותיה לthrombolysis tPA עם או בלי Edaravone. Edaravone היא נבלות רדיקלים חופשיות שכבר אושרו ביפן לטיפול בשבץ איסכמי בתוך 24 שעות מהופעת 9. הניסויים שלנו הראו כי HI כקצר כ30 דקות חולפות מפעיל אוטם טרומבוטיים, וכי טיפול tPA-Edaravone שילוב מקנה 8 יתרונות סינרגטיים. כאן אנו מתארים ניתוחים מפורטים ושיקולים מתודולוגיים של מודל תי, אשר ניתן להשתמש בי כדי לייעל טיפולי reperfusion של שבץ איסכמי חריף.
Protocol
Representative Results
Discussion
שבץ הוא בעיה בריאותית משמעותית של גידול משמעות לכל חברה עם אוכלוסייה מזדקנת. בעולם, שבץ הוא הגורם מוביל השני של מוות עם 5.9 מיליון אירועים משוערים קטלניים בשנת 2010, שווה ערך ל 11.1% מכל מקרי המוות 18. שבץ הוא גם הגורם מוביל השלישי של שנות חיים מותאמות לנכות (DALYs) איבד בר?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.
Materials
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~13 weeks old (22~30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in-vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in-vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in-vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-braina imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research–advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3. r. d., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow’s triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed–specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
