Introduction
De meeste bacteriële cellen zijn in staat om zowel plankton (vrij levende) en oppervlak bevestigd (zittend) vormen van de groei 1 in dienst. In het oppervlak gehecht groeiwijze, bacteriële cellen scheiden en omsluiten zich in grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS) biofilms te vormen. De EPS bestaat voornamelijk uit proteïnen, exopolysaccharide, extracellulair DNA en essentieel voor biofilmvorming 2. Het dient als een fysieke scaffold waarmee bacteriën kunnen gebruiken om ruimtelijk te differentiëren en beschermt de bacteriën tegen schadelijke omgevingsfactoren en gastheerreacties. Verschillende componenten van EPS hebben verschillende functies in biofilmvorming 3 en veranderingen in de expressie van EPS componenten drastisch verbouwen biofilm structuren 4. EPS componenten kunnen eveneens als signaalmoleculen 5, en recente studies is gebleken bepaalde EPS componenten interactie met microbiële cellen om de migratie en biofilm diff gidsdifferentiatie 6-8.
Onderzoek naar de EPS sterk geavanceerde basis van de morfologische analyse van biofilms door mutanten in een bepaald deel van de EPS 9,10. Bovendien wordt de EPS gewoonlijk gekarakteriseerd op macroschaal (bulk karakterisering) 11. Morfologische analyse kan echter kwantitatief detail en bulk karakterisering, waarbij de gemiddelde waarden oplevert, verliest de details die in de heterogeniteit van de biofilm bestaat missen. Er is nu een stijgende trend op weg naar real-time karakterisering van de mechanische eigenschappen van EPS op micro-schaal. Dit protocol toont hoe particle tracking Microreologie kan de spatiotemporele effecten van matrixcomponenten Pel en Psl exopolysacchariden de visco-elasticiteit en effectieve vernetting van Pseudomonas aeruginosa biofilms 4 bepalen.
Passieve Microreologie is een eenvoudige en goedkope rheology methode die de hoogste omzet ruimtelijke microrheological bemonstering van een materiaal date 12,13 bepaalt. In passieve Microreologie zijn sonde bolletjes in het monster geplaatst en hun Brownse beweging, gedreven door thermische energie (k B T) wordt gevolgd door video-microscopie. Meerdere deeltjes kunnen gelijktijdig worden gevolgd, en de tijdsafhankelijke coördinaten van de deeltjes na een conventionele random walk. Daarom, gemiddeld, de deeltjes blijven op dezelfde positie. De standaarddeviatie van de verplaatsingen en de gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) van de deeltjes, niet nul. Sinds visceuze vloeistoffen vloeien, het deeltje MSD in een stroperige vloeistof lineair groeit naarmate de tijd vordert. In tegenstelling, de polymere verknoping in visco-elastische of elastische stoffen helpen om stroming te weerstaan, en deeltjes worden in beperkte verplaatsing, waardoor plateaus in de MSD curve (figuur 1A). Deze constatering volgt de relatie MSDαt
De grootte, dichtheid en oppervlaktechemie van het deeltje is kritisch voor de juiste toepassing van microrheological experiment en worden gekozen met betrekking tot het bestudeerde systeem (in dit geval de polymeren van de biofilm matrix, zie figuur 1B). Ten eerste, het deeltje meet de reologie van de stof met structuren die veel kleiner is dan het deeltje zelf zijn. Als structuren van de stof van vergelijkbare schaal het deeltje, de beweging van de nominalekel wordt verstoord door de vorm en oriëntatie van de individuele structuren. Indien de structuren rond het deeltje veel kleiner, dit effect is klein en uitgemiddeld, die een homogene omgeving om de deeltjes (Figuur 1B). Ten tweede moet de dichtheid van het deeltje vergelijkbaar met het medium (1,05 g -1 ml voor watergedragen mediums) zodanig, dat bezinking vermeden en traagheidskrachten verwaarloosbaar. De meeste deeltjes met polystyreen roosters aan bovenstaande criteria voldoen. In het ideale geval bevat het deeltje niet communiceren met de polymeren van de biofilm matrix als rheologische interpretatie van deeltjes MSD geldt alleen als er beweging is willekeurig, gedreven door thermische energie en botsingen met substantie structuren. Dit kan worden waargenomen door te controleren of de probe deeltjes de neiging te binden of stuiteren van het oppervlak van een pre-volwassen biofilm. Ondanks het ontbreken van aantrekkingskracht van de biofilm, moet de deeltjes kunnen in de matrix worden opgenomen.Bovendien kan de fysiochemische heterogeniteit van de biofilm resulteren in verschillende deeltjes geschikter als probes in verschillende gebieden van de biofilm. Daarom moet deeltjes van verschillende grootte en oppervlaktechemie worden toegepast op de biofilm.
Als zodanig, de deeltjes MSD kan nuttige informatie over verschillende componenten bijdragen aan de reologie en de verspreiding van de biofilm verschaffen. Bovendien is het gebruik van verschillende probes maakt het mogelijk om informatie te verkrijgen over de ruimtelijke fysisch heterogeniteit van de biofilm. Deze methode kan worden gebruikt om het effect te testen op antimicrobiële behandeling de mechanische eigenschappen van de biofilm of toepassing op gemengde species biofilms te onderzoeken hoe de mechanische eigenschappen van de biofilm worden veranderd van introductie van een andere soort. Deeltjes MSA kan ook nuttig zijn voor het karakteriseren van biofilm dispersie zijn. Dergelijke studies zou nuttig zijn in ons begrip van biofilms, mogelijk het verbeteren van biofilm behandelingen eennd engineering van biofilms voor nuttige activiteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm Teelt
- Bereiding van bacteriële stammen
- 1 dag voor cultivatie biofilm bereiden planktonische bacterieculturen enten van 2 ml van de geschikte groeimedium uit bevroren bacteriecultuur. Gebruik Luria-bouillon medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 gistextract, en 10 g L -1 trypton) voor mucoïde P. aeruginosa en de Δ pel en Δ PSL defecte mutanten. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 200 rpm geschud. Verdun overnachtkweken tot een OD 600 van 0,40 met behulp van een spectrofotometer.
- Monteer stroomcel instelling, die is eerder beschreven 14, bij voorkeur een mobiel station of een trolley die in de microscoop kamer kan worden gebracht voor het afbeelden van de stroomcel zonder demontage.
- Bereid steriel groeimedium in 2 L of 5 L flessen voor elke stroom cel. Gebruik minimaal medium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mmKH 2PO 4, 19 mM NH4Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 en 0,1 mM CaCl 2) aangevuld met 0,04% glucose (gew / vol) en 0,2% (wt / vol) casaminozuren) voor P. aeruginosa stromen cel biofilms.
- Aliquot fluorescerende microbolletjes in microcentrifugebuizen en spin in steriele H 2 O voor 5 min in centrifuge bij 9,391.2 g. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 ml kweekmedium met natriumazide (desinfectiemiddel) te verwijderen voorafgaand aan het toevoegen aan groeimedium in 2 L of 5 L medium flessen.
LET OP: Verschillende maten van microsferen zijn er in verschillende concentraties en dienovereenkomstig moeten worden verdund tot instructies. Bijvoorbeeld, dispergeren 120 gl 1,0 urn diameter microsferen, 15 gl 0,5 urn diameter microsferen en 0,96 pl 0,2 urn diameter microsferen in 2 liter groeimedium tot 2,18 x 10 6 microsferen -1 ml voor elke deeltjesgrootte. - Hechten medium fles upstriem stroom cel en laat groeimedium te stromen door hele setup. Stop stroom en injecteer verdund nachts culturen in flow cel kamers. De bacteriën te hechten aan de ondergrond dekglaasje gedurende 1 uur alvorens verder stroom groeimedium bij een stroomsnelheid van ongeveer 5,5 x 10 -3 m sec -1 of 8 min met een peristaltische pomp.
OPMERKING: Biofilms zijn meestal gekweekt bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 3-7 dagen. - Als alternatief voor de statische cultuur setup, verdunnen 's nachts culturen 100-voudige in microcentrifugebuizen door het toevoegen van 10 pi' s nachts cultuur 1 ml groeimedium met deeltjes. Verhoging van de deeltjesconcentratie in het groeimedium voor statische kweek ongeveer 500-voudig vergeleken met die voor stroming biofilms (bijvoorbeeld wassen en resuspenderen 600 ui 1,0 urn diameter bollen in 10 ml groeimedium) als stroomcel biofilms voortdurend aangevuld met deeltjes maar statische culturen niet.
- Voeg 2001; l verdund 's nachts cultuur met deeltjes tot de kamers van 8 en dia's. Incubeer bij 37 ° C onder statische omstandigheden. Biofilms zijn meestal gekweekt voor 1 dag. Vervang groeimedium besteed dagelijks vers groeimedium met deeltjes als biofilm wordt geteeld voor meer dan 1 dag.
2. Microscopie
- Op dag 3 en 5, uit te schakelen stroom uit peristaltische pomp en breng stroom cel instellen in de microscopie kamer. Klem slang bij de ingang en uitgang van de stroom cel kamers om drift (een systematische fout veroorzaakt door veranderingen in het milieu) van stroom te voorkomen. Plaats de stroomcel naar de microscoop stadium van een rechtopstaande microscoop.
OPMERKING: Gebruik een omgekeerde microscoop voor beeldvorming van microwells. - Met fluorescentiemicroscopie met 40X olie doel's van microsferen beweging ingebed in de biofilm op verschillende locaties (microkolonies en platte ongedifferentieerde lagen) en verschillende dagen (dag 3 en 5) te nementijd en ruimte onderzoeken. Neem kortere video's met een hogere framesnelheid om gebeurtenissen die zich binnen korte tijdschalen onderzoeken (bijvoorbeeld 1,5-3 min video's bij framerate van 25-50 frames per seconde voor snelle dynamiek), en langere video's met een lagere framerate op gebeurtenissen over langere tijd te onderzoeken schalen (bijv 15-30 min video's bij frame rate van 2,5-5 beelden / sec voor langzamere dynamiek).
OPMERKING: Een video bevat gewoonlijk 5-10 deeltjes, en is meestal van 1,0-2,5 GB in bestandsgrootte. Grotere microkolonies kunnen meer deeltjes bevatten. Neem 5-10 video's voor elke categorie (bijvoorbeeld 5-10 video's van verschillende microkolonies en van verschillende lokaties in flat ongedifferentieerde lagen). De biofilm is een heterogene architectuur die kan bestaan uit microkolonies, kanalen, holle ruimten en platte ongedifferentieerde lagen. - Besparen video's in de juiste formaat dat kan worden gelezen door Fiji / ImageJ (bijv czi, tif).
- Controleer video's voor de drift door te bladeren door de afgewerkte video en observeren dat de deeltjes niet bewegen in dezelfde richting tegelijkertijd. Drift kan worden veroorzaakt door z-fase beweging stromen in de stroomcel, onbalans antivibratietafel, luchtdruk of temperatuurveranderingen. Correcte kleine drijven met behulp van post-processing technieken meestal voorzien microscoop software. Gooi alle video's waarin drift niet kunnen worden gecorrigeerd. Noteer de volgende parameters, die nodig zijn tijdens de Particle Tracking Analyse: Resolutie (px / um), aantal frames, duur.
- Verwijder stroom cel uit microscoop podium en start peristaltische pomp te blijven cultiveren van de biofilm.
3. Particle Tracking Analyse
- Verkrijgen deeltje trajecten met behulp van de plug-in TrackMate in open source software (ImageJ). Download Fiji op http://fiji.sc/Fiji. Open de video die met Fiji en onder het Plugins menu, selecteer Tracking en TrackMate.
- Controleer of de instellingen in th passene venster suggereert initiële kalibratie-instellingen om de video parameters passen zoals vastgelegd in stap 2.4.
- Detecteren deeltjes in TrackMate behulp ImageJ.
- Selecteer 'log-detector', ingang deeltjesdiameter en drempelwaarde (bijvoorbeeld 1000). Blader door de video, terwijl klikken op 'Preview' knop om te controleren of de paarse cirkels volgen de deeltjes in de hele video. Pas de diameter en drempelwaarden als noodzakelijk is: verhoging van de drempelwaarde als paarse kringen verschijnen in de lege ruimte. Verlaag de drempelwaarde als er niet voldoende deeltjes worden gedetecteerd. Klik op de volgende knop om detectie te voltooien de deeltjes.
- Klik op de knop Volgende wanneer voorgesteld met de optie toe te voegen of te verwijderen deeltjes ontdekt in 'Initial thresholding', 'Selecteer een view' en 'Selecteer een filter' ramen te blijven, zonder aanpassing als eerste deeltje detectie was bevredigend.
- Selecteer 'Simple LAP tracker' in het optiop de bar van 'Selecteer een tracker methode' window als deeltjes zelden verplaatsen van de focus op de biofilm en zijn gemakkelijk gevolgd. Gebruik de voorgestelde of lage koppeling en gap-closing max afstand waarden en klik op Volgende.
- Controleer dat deeltje tracking is bevredigend door te bladeren door de video te zien dat deeltjes volgen getrokken door TrackMate tracks, en dat er geen ongewenste of ontbrekende tracks. Sla de verschillende filtering stappen. Ga naar het laatste venster 'Kies een actie'. Selecteer 'Export tracks naar xml-bestand' uit het drop down menu en klik op 'Uitvoeren'. Kies een map om de tracks op te slaan.
NB: Er zijn verschillende programma's beschikbaar in het publieke domein voor de analyse van deeltjes trajecten en het gebruik van Microreologie. msdanalyzer en TrackArt zijn voorbeelden van deeltjes volgen analyse programma's die in de Matlab-omgeving.
- Bereid Matlab om het deeltje trajecten in de XML-bestanden importeren door te selecteren in het menu vanMatlab Bestand> Stel Pad ... en voeg de map scripts verkrijgbaar met de Fiji-pakket.
- Om het deeltje trajecten met msdanalyzer te analyseren, te downloaden op de link naar het zip-bestand of het tar.gz bestand at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Pak hetmsdanalyzer map 15 en zet het in een map die behoort tot de Matlab pad (bijvoorbeeld C: Documents and Settings <Gebruikersnaam> Mijn documenten Matlab). Start Matlab en inleiding van de analyser door te typen:
ma = msdanalyzer (2, 'eh', 'sec')
waarbij um en sec zijn de fysieke ruimte en tijd eenheden in de video.- Importeer het deeltje trajecten door te typen:
[tracks, md] = importTrackMateTracks ('filename.xml', 'clipz';, 'Scalet')
ma = ma.addAll (sporen);
waarbij 'clipz' verwijdert de z dimensie voor een 2D-video, en 'Scalet'. - Plot van de trajecten op grafiek met behulp van:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Bereken de SSA van de deeltjes met behulp van:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - Plot de MSA van elk deeltje:
figuur
ma.plotMSD - Combineer deeltje trajecten uit andere video's van dezelfde categery (bv deeltjes ingebed in wild-type microkolonies op dag 3) door het herhalen van 3.5.1.1 naar 3.5.1.4).
- Plot het ensemble gemiddelde of het gemiddelde over alle bochten:
ma.plotMeanMSD
Wijzig de Y- en X-as van het lineair logaritmische schaal. Op lange vertraging tijden, het MSD bochten worden luidruchtig te wijten aan onvoldoende statistieken op langere tijdschalen. De MSD bochten kan ook sterk stijgen als gevolg van dynamische fouten. Deze gebieden van de curve kan worden verwijderd met het penseelaan het einde van de curve te selecteren en te kiezen voor 'borstelen'> 'Verwijder unbrushed' in het menu Extra.
- Importeer het deeltje trajecten door te typen:
- Download Ezyfit bij http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ en voeg Ezyfit naar een map die behoren tot de Matlab pad (bijvoorbeeld C: Documents and Settings <Gebruikersnaam> Mijn documenten Matlab). Installeer de Ezyfit menu door te typen in Matlab werkruimte efmenu installeren. Herstart MATLAB met Ezyfit menu in de figuur venster. Breng de MSD bochten om de macht wet door het selecteren in het menu Ezyfit 'Show Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' waren n is de geschatte diffusief exponent α.
OPMERKING: msdanalyzer vereist de Curve Fitting Toolbox in Matlab voor het aanbrengen van MSD bochten. Ezyfit is een alternatief en gratis software die kan uitvoeren curve fitting. - Clear huidige deeltje trajecten en MSA nieuwe deeltje SSA op andere locaties of de tijd te berekenen:
duidelijk Na berekening van de verschillende gemiddelde MSD rondingen van deeltjes in medium (controle), en microkolonies en ongedifferentieerde gebieden van verschillende stammen, kopieer en plak de bochten in een grafiek te vergelijken. Monster stijfheid en verknopen toename met lagere MSD waarden. Platte bochten hebben een lagere α en het monster is elastischer dan steilere bochten met een hogere α. - Selecteer de bocht en ga naar "Tools" te kijken naar de gegevens statistieken, zoals de mediaan en bereik. De MSD van de kraal is evenredig met de kruip compliance, J (t) van het materiaal waarin de kraal is ingebed volgens de relatie
waarbij J = kruip compliance, d = deeltjesdiameter, k B = Boltzmann constante, T = temperatuur en t = tijd.
- Pak hetmsdanalyzer map 15 en zet het in een map die behoort tot de Matlab pad (bijvoorbeeld C: Documents and Settings <Gebruikersnaam> Mijn documenten Matlab). Start Matlab en inleiding van de analyser door te typen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lokale visco-elastische eigenschappen van de biofilm in verschillende gebieden van de biofilm, waarbij de holten (gemiddeld boven de biofilm), vlakten (vlakke laag ongedifferentieerde cellen) en microkolonies (zie labels in figuur 2A) inclusief onderzocht. De tijdelijke veranderingen in de visco-elastische eigenschappen van de biofilm gedurende rijping van dagen 3-5 werden bepaald. De MSD van de deeltjes in de holtes werd gebruikt als een controle en vergelijkbaar met de MSD deeltjes in zuiver medium. Daarentegen deeltjes gevangen in de biofilm trilling op vaste posities en MSD waarden varieerden van typisch die van visco-elastische materialen sterk elastische gels (figuur 3).
Mucoïde P. aeruginosa wild-type en mutante stammen Δ pel (figuur 2A en 2B) ontwikkeld microkolonies verspreid op een dunne vlakte van dag 3 in de biofilms. De vlakte op dag 3 was te dun voor deonderzoek naar rheologische eigenschappen. In beide biofilms gevormd door mucoïde P. aeruginosa wild-type en Δ pel stammen de MSD deeltjes in de dag 3 microkolonies was onafhankelijk van de tijd voor vertragingen van 0,1 sec tot 10 sec (α = 0), wat aangeeft dat de microkolonies werden elastische (Figuur 4, Tabel 1) . De mediaan kruip nalevingen berekend op basis van de corresponderende deeltje SSA waren 4,3 x 10 -2 Pa -1 en 3,6 x 10 -2 Pa -1 respectievelijk. Op dag 5 van de kruip naleving van de microkolonies in mucoïde P. aeruginosa wildtype verhoogd tot 2,5 x 10 Pa -1 -1, hetgeen een vermindering van de effectieve crosslinking binnen de matrix. De dag 5 microkolonies waren nog elastiek met α = 0. Δ pel veranderde niet in reologie van dagen 3 tot 5. De vlakten in mucoïde P. aeruginosa wild-type en Δ pel stammen waren SimiLAR in elasticiteit (α = 0) en effectieve verknoping tot dag 3 microkolonies die een afspiegeling is van hun looptijd (ongedifferentieerde structuur) zou kunnen zijn.
Biofilms gevormd door Δ PSL mutante stam (figuur 2C) waren minder gedifferentieerd en vertraging in de ontwikkeling. Dit resulteerde in biofilms met dikke vlakten die microkolonies ontwikkeld na dag 3. De MSD waarden toonden aan dat de biofilms waren veel minder effectief verknoopt dan P. aeruginosa wildtype en Δ pel stammen (Figuur 4, Tabel 1). De vlaktes waren visco-elastische, met α = 0,12 en 0,26 op de dagen 3 en 5 respectievelijk. De mediane kruip naleving van de dag 3 en 5 vlaktes was 1,0 Pa -1. Bij microkolonies op dag 5 had ontwikkeld, was de kruip overeenstemming daalde tot 2,8 x 10 Pa -1 -1, wat aangeeft dat een drempelwaarde verknoping nodig is voor microkolonie differentiatie. However, de kruip naleving was nog steeds groter dan de kruip naleving van de jongere dag 3 mucoïde P. aeruginosa wild-type en Δpel microkolonies. De dag 5 microkolonies werden viscoelastische met α = 0,34. Aldus, de P. aeruginosa biofilm is elastisch en sterk verknoopt in afwezigheid van Pel. Bij afwezigheid van Psl, de biofilm werd visco-elastische en minder verknoopt. In de mature biofilm structuren zoals de microkolonies, expressie van zowel Pel en Psl exopolysacchariden resulteerde in verschillende rheologische verschillen in de tijd. De vermindering van verknoping kan worden veroorzaakt door de reductie van Psl Pel exopolysacchariden de biofilm matrix tijdens rijping.
Figuur 1:. Particle volgen Microreologie in een biofilm (A) Gray cirkels verbeelden deeltje MSD in een stroperige substantie, die lineair groeit met de tijd enα = 1 driehoekjes tonen deeltje MSD van een elastische stof, die onafhankelijk van tijd en a = 0 (B) Schematische weergave van probe deeltjes trillen in het EPS van de biofilm. Het deeltje wordt gemodelleerd als een bacteriecel en heeft dezelfde diameter. De matrix polymeren die het deeltje omhullen zijn veel kleiner dan het deeltje.
Figuur 2: P erspecti v e en sectionale vi e w van d a y 5 biofilms (groen) b y con f okale Micr p y na conti n overbodig < strong> f eeding met 1,0 μ m (paars), 0,5 μ m (rood) en 0,2 μ m (oranje) pa r kelen met negatief geladen gecarboxyleerde oppervlak. biofilms gevormd uit (A) mucoïde P. aeruginosa, en mutanten (B) Δ pel en (C) Δ psl stammen. Deeltjes zijn opgenomen in alle regio's van de biofilm. Voorbeelden van microkolonies, vlaktes en holten worden gelabeld (A). Gewijzigd van Chew et al., MBIO, 2014 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Particle trajecten Vergelijking van een track van een deeltje uitvoeren Brownse beweging in groeimedium (veelkleurige) vergeleken met sporen van deeltjes trillen in biofilm microkolonies (donkerblauw). De gesegmenteerde kleuren geven pauzes volgen wijten aan deeltjes verplaatsen van de focus op de z-vlak.
Figuur 4:. MSA van 1,0 micrometer deeltjes in biofilms mucoïde P. aeruginosa is elastisch en microkolonies verminderd effectieve crosslinking van dagen 3-5; Δ pel is elastisch en niet verandert reologie van dagen 3-5; Δ PSL is visco-elastisch en bestaat voornamelijk uit vlakten die niet significant veranderen reologie van dagen 3-5.
| Spanning | Dag | Regio </ td> | Mediaan Creep Compliance (Pa -1) |
| wilde type | 3 dagen | Microkolonie | 4,3 x 10 -2 |
| wilde type | 5 dagen | Microkolonie | 2,5 x 10 -1 |
| wilde type | 5 dagen | Vlakte | 4,1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 dagen | Microkolonie | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 dagen | Microkolonie | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 dagen | Vlakte | 3,2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 dagen | Vlakte | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 dagen | Vlakte | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 dagen | Microkolonie | 2,8 x 10 -1 |
Tabel 1: Median kruip nalevingen en verwachte diffuse exponenten van wild-type en mutante stammen volgens biofilm leeftijd en regio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microreologie is een nuttig instrument voor de lokale rheologische metingen in heterogene systemen, zoals microbiële biofilms. Het is een niet-destructieve techniek, zodat de real-time monitoring van reologische veranderingen binnen dezelfde biologische monster over meerdere tijdstippen. In dit protocol werd deeltjes volgen Microreologie toegepast op Pel en Psl exopolysaccharide mutanten om te onderzoeken hoe ze invloed hebben op de elasticiteit en effectieve verknoping van de biofilm matrix. PSL is voorstander van de ontwikkeling van de elastische biofilms met hoge effectieve verknoping, terwijl Pel gunsten visco-elastisch en losser biofilms. Wanneer beide exopolysacchariden worden geproduceerd, wordt de biofilm microkolonies minder effectief verknoopt als biofilm rijpt, in overeenstemming met een afname van Psl dan Pel.
Biofilms gevormd door verschillende soorten bacteriën hebben verschillende EPS composities. De winst per aandeel van mucoïde P. aeruginosa stammen in deze studie voornamelijk consi st van exopolysacchariden 16. Andere soorten kunnen grote extracellulaire adhesie-eiwitten 17 en 18 DNA als hun belangrijkste onderdelen van de EPS gebruiken. De hier beschreven benadering kan worden gebruikt om de rheologische bijdrage van andere EPS componenten en hun effect op de groei te bepalen. Bovendien kunnen biofilms gekweekt in verschillende opstellingen sterk verschillende fysische eigenschappen die de reologie beïnvloeden. Bijvoorbeeld, mucoïde P. aeruginosa aangevuld met glucose vormt meer biofilm met zeer gedifferentieerde structuren onder stroom in vergelijking met statische omstandigheden. Studies hebben ook aangetoond dat biofilms blootgesteld schuifspanning zoals stroming maakt de biofilms meer samenhangend en elastisch 19,20. Belangrijke stappen en factoren te overwegen voor een succesvolle biofilm particle tracking Microreologie studie zijn als volgt:
Het systeem afmetingen voor onderzoek of omvang van belang met betrekking tot tijd en ruimte
content "> Bij de behandeling ruimtelijke schaal, moet men rekening houden met de grootte van de structuren die tot de visco-elastische eigenschappen van het systeem te geven (in ons geval de polymeren van de biofilm matrix) dienen. De polymeren rondom de sonde deeltje veel kleiner zijn structuur dan het deeltje en presenteren een isotrope omgeving om de deeltjes. Hoge-resolutie beeldvorming nodig om kleine deeltjes beweging of trillingen te vangen, maar de oppervlakte die afgebeeld voor gelijkwaardige bestandsgrootte te verminderen. Bij het overwegen tijdschalen, elastische biofilms die langzaam vertonen dynamiek vereisen nemen videos over langere tijdschalen (bijv hr) en het gebruik van lage framerates (bv min). Kortere video's kunnen worden genomen voor visco-elastische biofilms met snelle dynamiek (min), maar vereisen een hogere frame rates (sec of millisec). Het gebruik van geschikte resolutie, frame rate, video-duur voor elk experiment zal bestand bewaren maten laag voor handelbaar analyse.Biofilm viscoelasticiteit, hijterogeneity en afmetingen
Deeltje beweging kan niet op te sporen in zeer elastisch biofilms (MSD <10 -4) zijn. In dat geval actieve microrheological technieken die kracht op het deeltje verplaatsen voorkeur. Rheologische bemonstering van de verschillende regio's van de biofilm moet worden gedaan om ervoor te zorgen de mechanische heterogeniteit van de biofilm wordt vastgelegd. Heterogene morfologie, maar niet noodzakelijkerwijs een goede indicator van mechanische heterogeniteit, want ondanks homogene schijn de biofilm complex reologie kunnen zijn: Δpsl biofilms homogener in morfologie en vertraagd differentiatie, maar hebben een complexe en heterogene reologisch profiel. Daarentegen Δpel biofilms een heterogene verschijning met goed gedifferentieerde microkolonies maar constant reologie gedurende de biofilm. Voor biofilms met grote microkolonie afmetingen (bijvoorbeeld> 50 urn in diameter en hoogte), kan het zinvol istudy de rheologische verschillen afhankelijk van de hoogte (boven en onderkant van microkolonies) of afstand van microkolonie rand.
Selectie van deeltjes probe
Zoals hierboven beschreven, moet de omvang van de deeltjes groter is dan de structuren van de materialen die gevaar voor visco-elastische eigenschappen te geven. Bovendien kunnen deeltjes met verschillende oppervlakte chemie leiden tot het binden aan verschillende gebieden en EPS componenten binnen de biofilm. Dus de effecten van deeltjes met verschillende oppervlakte chemie worden onderzocht zodat biofilm heterogeniteit kunnen worden overwogen. Alle sonde deeltjes moet een hoge zetapotentiaal agglomeratie minimaliseren. Deeltjes die samenbinden kan niet worden gebruikt als probes en nauwkeurig moeten worden uitgesloten uit de analyse.
Minimalisering van drift
Drift kan worden veroorzaakt door temperatuur of luchtdruk veranderingen microscoop verkeerspodium (meestal in de z-richting), anti-vibration tafel onbalans en interne doorstroming binnen het systeem. Afwijkingen meestal resulteren in superdiffuzionen van het deeltje en α> 1. Een α> 1 geeft aan dat andere dan thermische energie, actieve processen betrokken zijn bewegende deeltjes en passieve Microreologie niet van toepassing is.
Goede biofilm cultuur onderhoud
Flow cellen moet goed worden gemonteerd om lekkages te voorkomen en biofilms moet verontreiniging vrij worden gehouden. Biofilms kunnen ook worden gekweekt in andere opstellingen alternatief voor de stroom cel, zoals glijbanen en microputjes statische kweekomstandigheden. Een omgekeerde microscoop moet worden gebruikt voor beeldvorming van microputjes.
Samengevat, deeltje volgen Microreologie is een nuttige techniek die kan worden toegepast met behulp microscopen standaard een biologisch laboratorium. Daarnaast, programma's die betrokken zijn bij de berekening en analyse van deeltjes MSA is direct beschikbaar in het publieke domein.Bijvoorbeeld msdanalyzer en TrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) zijn programma's die in de Matlab-omgeving. Omdat de techniek berust uitsluitend thermische energie aan de deeltjes te bewegen, is het niet oplossen tussen monsters van grotere elasticiteit. Actieve technieken zoals magnetische pincet, toepassen van een kracht op het deeltje inwerken en zich binnen het monster en kan de visco-elasticiteit van zeer elastische monsters te bepalen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door de National Research Foundation en het ministerie van Onderwijs van Singapore onder haar Research Centre of Excellence Programma, de Start-up Subsidies (M4330002.C70) van de Nanyang Technological University, en ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) van het ministerie van Onderwijs, Singapore. De auteurs danken Joey Yam Kuok Hoong voor deelname aan de demonstratie van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
