Abstract
Colture organotipiche permettono la ricostituzione di un ambiente 3D critico per interazioni di contatto cellula-cellula e cellula-matrice che imita la funzione e la fisiologia dei loro omologhi dei tessuti in vivo. Questo è esemplificato da culture pelle organotipiche che riassume fedelmente la differenziazione epidermica e il programma di stratificazione. Cheratinociti epidermici primari umani sono geneticamente manipolabile attraverso retrovirus in cui i geni possono essere facilmente overexpressed o abbattuti. Questi cheratinociti geneticamente modificati possono poi essere utilizzati per rigenerare epidermide umana in colture organotipiche della pelle che forniscono un modello potente per studiare percorsi genetici di crescita epidermico impattante, la differenziazione e la progressione della malattia. I protocolli qui presentati descrivono metodi per preparare derma umano devitalizzati nonché manipolare geneticamente cheratinociti umani primari per generare culture organotipiche pelle. Pelle umana rigenerata può essere utilizzato in downstrapplicazioni EAM come il profilo di espressione genica, immunostaining, e immunoprecipitazioni cromatina seguiti da sequenziamento ad alta produttività. Così, la generazione di queste culture organotipiche pelle geneticamente modificati consentirà la determinazione di geni cruciali per mantenere l'omeostasi della pelle.
Introduction
L'epidermide umana è un epitelio stratificato che si collega al derma sottostante attraverso una matrice extracellulare noto come l'epidermide zone.The membrana basale non serve solo come una barriera impermeabile per evitare la perdita di umidità, ma anche come una prima linea di difesa per proteggere la corpo dalle sostanze estranee e tossiche 1. Lo strato basale, che è lo strato più profondo dell'epidermide, contiene le cellule staminali epidermiche e progenitrici che danno luogo alla progenie differenziata che formano il resto dell'epidermide 2. Come le cellule progenitrici epidermiche differenziano migrano verso l'alto per formare il primo strato di cellule differenziate note come strato spinoso 3. Nello strato spinoso, cellule attivano l'espressione di cheratine 1 e 10, che quindi fornisce la forza di resistere allo stress fisico per gli strati differenziati dell'epidermide. Come le cellule strato spinoso ulteriormente differenziano, si muovono verso l'alto nell'epidermide a perm strato granulare che è caratterizzata dalla formazione di keratohyalin e lamellari granuli così come proteine strutturali che vengono assemblati sotto la membrana plasmatica. Poiché le cellule procedere nel processo di differenziazione, le proteine sotto la membrana plasmatica sono trasversali collegati tra loro, mentre i granuli vengono estrusi lamellari dalle cellule per formare una barriera lipidica ricco chiamato strato corneo 4.
Malattie che coinvolgono alterazioni nella crescita epidermico e impatto differenziazione ~ 20% della popolazione 5. Così, la comprensione dei meccanismi di questo processo è di grande importanza. Dal momento che la manifestazione di molte di queste malattie è subordinato cellula-cellula o cellula-matrice contatto, colture organotipiche dove l'epidermide umana è ricostituito in un ambiente 3D sono stati creati 6-10. Questi metodi tipicamente comportano l'uso di cheratinociti primari o trasformati seminate su matrice extracellulare come devitalizzati umanaderma, Matrigel o collagene.
Per comprendere gene meccanismi di regolamentazione che sono importanti nella crescita e differenziazione epidermica, cheratinociti possono essere geneticamente manipolati tramite vettori retrovirali per atterramento o iperespressione di geni nella cultura 2D e poi ricostituito in 3D. Questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare i geni coinvolti nella epidermica staminali e cellule progenitrici auto-rinnovamento e la differenziazione, nonché la progressione di neoplasia 11-21. Qui, è previsto un protocollo approfondito su come modificare l'espressione genica in colture organotipiche epidermiche attraverso l'uso di retrovirus.
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Protocol
Il protocollo pelle umana è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of California, Ricerca Comitato Etico di San Diego. La pelle umana può essere ottenuto da campioni chirurgici scartati o comprato da banche della pelle (pelle banca è elencato nella tabella Materiali / Equipment). La posizione in cui la pelle è realizzata o età del donatore non è critico per l'esperimento finché le proteine membrana basale (collagene / laminina) nel derma non sono degradati.
1. Preparazione di devitalizzate derma umano
- Alla ricezione di pelle umana, posizionare il tessuto nella cappa coltura tissutale per scongelare (~ 3-5 min). A seconda delle dimensioni della pelle, posizionare il tessuto scongelato in un monouso tubo da 50 ml o 125 ml sterile bottiglia. La dimensione tipica della pelle da parte della banca pelle è di 0,75 mq.
- Riempire il serbatoio pieno al 75% con 4x la penicillina e streptomicina (penna / strep) in PBS 1x. Agitare energicamente per5 min e smaltire il liquido. Ripetere questa operazione altre 3 volte.
- Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il tessuto in una nuova provetta / bottiglia e aggiungere 4x fresco pen / strep / PBS per riempire 75% del contenitore. Incubare questa miscela in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per 2 settimane per consentire la separazione del derma dell'epidermide.
- In condizioni sterili, utilizzare una pinza a staccarsi l'epidermide dal derma. Il derma è completamente bianco, mentre l'epidermide avranno colorazione a seconda della razza del donatore (Figura 1A). Eliminare l'epidermide secondo il protocollo dell'istituzione per affrontare con i tessuti umani.
- Posizionare il derma in un tubo o bottiglia e lavarlo in 4x penna / strep diluito in PBS 1x con vigorosi tremanti (5 min lavaggi per 4 volte). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il derma in una nuova provetta / bottiglia in 4x penna / strep diluito in PBS 1x e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Derma possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di un anno. 2. modificare geneticamente cheratinociti umani primari
- 1 ° giorno: Il giorno prima trasfezione, le cellule fenice seme in un 6-pozzetti ad una densità di 800.000 cellule per pozzetto nei media DMEM completo.
- Giorno 2: Il giorno della transfezione, utilizzare 3 mg di vettori retrovirali per pozzetto. Aliquotare 3 mg di vettore retrovirale in una provetta da 1,5 ml. Utilizzare un mix di 100 μ; l DMEM più 6 ml di reagente di trasfezione per ogni 3 mg di vettore. Mescolare 6 ml di reagente di trasfezione con 100 microlitri DMEM in una provetta da 1,5 ml. (I vettori retrovirali che vengono utilizzati sono elencati nella tabella attrezzature / materiali).
- Incubare per 5 minuti e aggiungere il composto di 106 microlitri nel tubo pre-aliquotati contenente 3 mg di vettore retrovirale. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere questa intera miscela gocce a ciascun pozzetto di cellule Phoenix.
- 3 ° giorno: Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il supporto dalle cellule phoenix e aggiungere 2 ml di fresco supporto completo DMEM. Lo stesso giorno, seminare cheratinociti umani primari in 6 pozzetti ad una densità di 75.000 cellule per pozzetto. Mantenere i cheratinociti in un mezzo di siero cheratinociti gratuito (KCSFM) con antibiotici (penna / strep).
NOTA: cheratinociti umani primari sono stati acquistati. Le cellule possono essere acquistati da una varietà di fornitori (elencati nella tabella Materiali / Equipment). - 4 ° giorno: Harconferire al supporto dalle cellule trasfettate fenice, che ora contiene particelle virali. Far passare il materiale attraverso un filtro da 0,45 micron con una siringa (per rimuovere tutte le cellule fenice contaminanti) e posizionare 2 ml sulle cheratinociti (placcato a 75.000 cellule / pozzetto del giorno precedente: vedere il punto 2.3). Aggiungere hexadimethrine bromuro (5 mg / ml) per i media per aiutare a mediare il processo di infezione. Titoli virali sono ~ 1 x 10 7 TU / ml.
- Spin piastre da 6 pozzetti in una centrifuga a 200 xg per 1 ora a RT. Dopo lo spin, rimuovere i supporti contenenti virus e lavare le cellule una volta con PBS 1x prima di aggiungere KCSFM.
- 5 ° giorno: infettare la stessa partita di cheratinociti di nuovo come al punto 2.4.
NOTA: Selezionare i cheratinociti usando un farmaco, se vi è un marcatore sul vettore retrovirale ed espandere per l'uso in analisi a valle o applicazioni come colture organotipiche. - Costruire ilcassetta organotipica da materiali comuni che si trovano in laboratorio o le cassette può essere personalizzato attraverso un negozio di fabbricazione di metallo (Figura 2A - F). Per rendere queste cassette da una piastra di coltura tissutale 3.5 cm, utilizzare un bisturi per rimuovere un 1,0 cm x 1,0 cm quadrato dal centro del coperchio di un piatto 3.5 cm (Figura 2A-B). Fate questo in condizioni di sterilità.
- Attaccare pioli quadrati sul fondo della cassetta (coperchio di 3.5 cm piatto) utilizzando smalto trasparente (Figura 2C). Lasciare 5 minuti per lo smalto si asciughi e capovolgere la cassetta sopra in modo che poggi sui pioli quadrati (Figura 2D). Posizionare la cassetta in un piatto 6 centimetri.
NOTA: Piazza pioli possono essere acquistati da una varietà di arti e botteghe artigiane.
- Attaccare pioli quadrati sul fondo della cassetta (coperchio di 3.5 cm piatto) utilizzando smalto trasparente (Figura 2C). Lasciare 5 minuti per lo smalto si asciughi e capovolgere la cassetta sopra in modo che poggi sui pioli quadrati (Figura 2D). Posizionare la cassetta in un piatto 6 centimetri.
- Preparare terreno di crescita dei cheratinociti (KGM) composto da 66% DMEM, il 22% F12 Ham, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, il 10% FBS, 2,67 mg / ml di adenina, 40 ng / ml idrocortisone, 10 ng tossina colerica ml /, 4,94 mg / ml di insulina, 5 mg / ml transferrina, 1.36 ng / ml triiodo-L-tironina, 10 ng / ml EGF, e 10 ug / ml cloridrato ciprofloxacina. Filtrare il mezzo attraverso un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Prendere il derma dalla 4x pen / strep + soluzione PBS e lavare 2 volte in KGM e incubare in KGM a 37 ° C per due giorni prima dell'uso.
- Tagliare il derma con un bisturi a 1,5 cm x 1,5 cm pezzi di dimensioni e quindi posizionare sul vassoio organotipica. Posizionare il derma con la parte superiore del derma rivolte verso l'alto. La parte superiore del derma sarà il lato che viene a contatto con i cheratinociti (Figura 1B).
- Posizionare il derma pretagliati sul foro quadrato della cassetta organotipiche con il lato superiore del derma rivolti verso l'alto (Figura 3A).
- Capovolgere l'intera cassetta organotipica contenente oltre il derma con pinze (Figura 3B). Scongelare la soluzione matrice extracellulare sul ghiaccio. Usare un ago e la siringa a tirar fuori 100 ml di soluzione di matrice extracellulare per cassetta. Aggiungere 5 gocce al fondo del derma (lato lucido) e agitare leggermente per assicurare una distribuzione derma (Figura 3B).
- Lasciare 5 minuti per la soluzione matrice extracellulare commerciale a solidificare completamente (Figura 3C). Dopo la solidificazione, utilizzare pinze per capovolgere il cassetto sopra. Aggiungere 4 ml di KGM al piatto 6 cm.
- Posizionare 0,5-1 milioni di cheratinociti geneticamente modificati sulle cassette organotipiche contenenti il derma (Figura 3D).
- Trypsinize cheratinociti mettendo 4 ml di 0,05% tripsina su piastre di 10 cm per 5 minuti e spegnere con 4 ml di mezzi DMEM completo.
- Contare i cheratinociti utilizzando un emocitometro e poi spin down a 200 xg per 5 min. Risospendere 0.5-1 milioni cellule (a seconda del numero di cellule disponibili) in 90 μl di KGM e posizionare tutte le cellule sulle derma.
NOTA: È importante posizionare lo stesso numero di celle sul derma nello stesso esperimento per garantire che eventuali differenze rilevate spessore dell'epidermide rigenerata non è dovuta a differenze nel numero iniziale di cellule. Posizionamento di meno di 0,5 milioni di cellule sul derma può portare a poveri stratificazione e la differenziazione.
- Modificare i media KGM sulle culture organotipiche ogni altro giorno. Tessuto raccolto 1-14 giorni dopo il posizionamento dei cheratinociti sulle derma. Stratificazione e la differenziazione completa dell'epidermide avviene di solito dopo giorno 5.
NOTA: utilizzare le cellule phoenix amphotropic cresciute nei media DMEM completo [DMEM + 10% siero bovino fetale (FBS) + pen / strep] per la produzione di virus per infettare cheratinociti umani primari. Geni imballaggio virali che codificano proteine come gag-pol e busta sono stabilmente integrati nel genoma della cellula Phoenix che consente la produzione di virus quando trasfettate con un vettore retrovirale. Phoenix cellule possono essere transfettate con alta efficienza che consente un'elevata produzione titolo virale. Virus prodotto da questa linea di confezionamento può infettare una grande varietà di cellule di mammiferi compreso umana.
3. Configurazione Culture pelle organotipiche
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Representative Results
Il primo passo nella generazione di pelle umana organotipica è rimuovere l'epidermide dal derma. I due settimana incubazione della pelle a 37 ° C in 4x pen / strep / PBS dovrebbe consentire la separazione del derma dall'epidermide (Figura 1A). Se la separazione dell'epidermide e del derma è difficile posizionare il tessuto a 37 ° C a 4x penna / strep / PBS per un'altra settimana e poi provare di nuovo peeling con pinze.
Una delle chiavi per rigenerare il derma epidermide umana devitalizzati è garantire che i cheratinociti sono collocati sul lato corretto del derma. Il derma ha una parte superiore ed una inferiore. La parte superiore del derma è il lato che viene a contatto con i cheratinociti in vivo e in colture organotipiche. La parte superiore del derma può essere differenziato dal fondo del derma causa della lucentezza del fondo (Figura 1B). Se cheratinociti sono posizionati direttamente sul fondolato (lucido) del derma, l'epidermide non differenziare o stratificare correttamente. Pertanto, è fondamentale avere la parte superiore del derma (non lucido) verso l'alto nel cassetto organotipica. Il derma possono essere posizionati direttamente su una cassetta organotipico (Figura 2A - F). Cassette a base di piastre di coltura dei tessuti devono essere sterilizzati ai raggi UV mentre metallo fabbricate cassette possono essere sterilizzati in autoclave prima di derma essere immessi sul. I cheratinociti geneticamente modificati possono quindi essere inseriti sui derma. I cheratinociti sono inizialmente immersi in liquido in quanto sono stati collocati sui derma risospeso in KGM. Dopo 24 ore il KGM avrà diffusa attraverso il derma che permette cheratinociti per essere esposti all'interfaccia aria-liquido che causa la stratificazione e differenziazione in epidermide 7 (Figura 3).
RNA, proteine, DNA / cromatina, così come sezioni di tessuto può essere raccolto dai s organotipicheculture kin che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle. RNA può essere usato per determinare le differenze di espressione genica tra il controllo e atterramento / tessuto sovraespressione utilizzando RT-QPCR, microarray, o RNA-Seq. DNA / cromatina può essere utilizzato per applicazioni di DNA o chip-Seq. La pelle rigenerata può essere montato in ottobre e sezioni congelate può essere utilizzato per immuno-colorazione o ematossilina e eosina per valutare la morfologia dei tessuti, l'espressione della proteina / localizzazione in controllo e gruppi sperimentali.
Un esempio di questo è mostrato in figura 4 con l'ematossilina-eosina di una tipica coltura organotipica pelle. Notare che tutti i quattro strati distinti dell'epidermide sono formati con strati specifica espressione di proteine correlate differenziazione (Figura 4) 11,12,14,15. Questo sistema può essere utilizzato per determinare gli impatti dei sovraespressione o knockdown di diversi geni sull'epidermide. Figura 5 mostra tessuto epidermico rigenerato che esprime il controllo, lacZ così come il tessuto sovraespresso per SNAI2. Sovraespressione di SNAI2 ha portato ad una inibizione della differenziazione epidermica come ha rilevato la mancanza di cheratina 1 (K1) colorazione così come la perdita di espressione di differenziazione indotta geni strutturali come TGM1 e SPRR1A (Figura 5A - C) 13,22. Lo spessore epidermico mostrato in figura 4 e figura 5 può variare all'interno stesso campione causa più cellule accumulano nel mezzo del derma rispetto periferia quando le cellule sono state inizialmente collocate sul derma. Pertanto, le sezioni centrali tendono ad avere epidermide spessa che la periferia tende ad avere più sottile. Per confronto diretto tra diversi campioni devono essere confrontate le stesse regioni di una sezione. Tuttavia, la colorazione per i marcatori dovrebbe rimanere costante.
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Figura 1. Preparazione del derma di pelle umana. (A) Dopo incubazione della pelle umana a 37 ° C per 2 settimane, il derma può essere separato dall'epidermide. Pinze vengono utilizzati per sbucciare l'epidermide (di colore marrone) dal derma (bianco). (B) La parte superiore del derma può essere distinto dal fondo dalla lucentezza del tessuto. La parte superiore del derma (il lato che naturalmente affrontare l'epidermide in vivo o in cui i cheratinociti saranno seminate) è non lucido. La parte inferiore del derma è lucida. Il tessuto è rosa a causa di incubazione in KGM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
FIGURA 2. Generazione di cassette organotipica. (A) Utilizzare un bisturi per rimuovere un 1,0 cm x 1,0 cm quadrati dal centro del coperchio di un piatto 3,5 centimetri. (B) Rimuovere la piazza dal centro del piatto 3,5 centimetri. (C) Usare smalto trasparente per aderire pioli quadrati. Lasciare 5 minuti per lo smalto si asciughi. (D) Aprire il coperchio sopra in modo che sia appoggiata sui pioli quadrati. La cassetta è ora pronto per essere utilizzato. (E) L'immagine di un metallo fabbricato cassetta organotipica con le sue dimensioni. (F) L'immagine di una cassetta di metallo fabbricato capovolto a testa in giù per mostrare i pioli di supporto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Generazione di organotculture pelle ypic. (A) Posizionare il derma con la parte superiore del derma (lato non lucido) rivolto verso l'alto sulla cassetta organotipica. (B) Aprire la cassetta più e aggiungere Matrigel al lato lucido del derma. (C) Lasciare 5 min per il Matrigel per solidificare e poi capovolgere il cassetto sopra. (D) Aggiungi geneticamente modificati cheratinociti al derma (0,5-1 milioni di cellule sono risospese in 90 ml di KGM). Raccolto il tessuto 1-14 giorni dopo la semina dei cheratinociti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. ematossilina e eosina di culture pelle organotipiche. Rigenerata pelle umana contiene sia l'epidermide e derma. L'epidermideè totalmente stratificato e differenziato con 4 strati distinti. Questi strati sono lo strato basale indifferenziata e 3 strati differenziati tra cui strato spinoso, granuloso e corneo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Immunofluorescenza e analisi di espressione genica di epidermide umana geneticamente modificati. (A) sovraespressione di SNAI2 inibisce la differenziazione epidermica. La colorazione per la proteina cheratina differenziazione 1 (K1) viene evidenziato in verde e nuclei è contrassegnato in blu (Hoechst). (B) RT-QPCR sui livelli di mRNA di SNAI2 in lacZ controllo e SNAI2 tessuti sovraespressione. Le barre di errore = SD, n = 3. (C) RT-QPCR sull'mRNAlivelli di trascrizioni di differenziazione KRT1, TGM1 e SPRR1A in lacZ controllo e SNAI2 tessuti sovraespressione. Le barre di errore = SD, n = 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La manipolazione genetica in pelle umana colture organotipiche offrono molti vantaggi a comunemente studiato 2D cellule in coltura e modelli di mouse. Culture 2D mancano i tre cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare interazioni dimensionali si trovano in tessuti e organi intatti. Recenti studi hanno anche trovato enormi differenze tra le colture di cellule tumorali della pelle 2D e 3D con le cellule in coltura 3D che mostra molto di più somiglianze di espressione genica per la pelle umana primaria tumori 16. Culture pelle organotipiche umani hanno anche diversi vantaggi rispetto ai modelli di mouse. Modelli murini sono lunga e costosa per generare così come molte differenze notevoli tra umano e la pelle del mouse. Questi includono diversi tassi di turnover tissutale nonché lo spessore dell'epidermide tra murine e epidermide umana 8. Con le nuove tecnologie emergenti come CRISPR-CAS, geni specifici possono essere modificate / mutato per modellare le malattie della pelle umana utilizzando cultur pelle organotipicaES 23. Inoltre, i geni possono essere consegnati o abbattuti in queste cellule attraverso una varietà di metodi, oltre al trasferimento genico retrovirale qui descritto. Finché vi è la consegna robusto attraverso l'alta efficienza di trasduzione o la selezione dei farmaci, il metodo può essere impiegato. Questi metodi di consegna includono nucleofection di siRNA, lentivirali, virus adenoassociated e virus adeno 11,12,24-26.
Le colture cutanee organotipica possono essere modificati aggiungendo diversi tipi di cellule del sistema. Ad esempio, fibroblasti umani normali o geneticamente modificati possono essere aggiunti al derma devitalizzati studiare mesenchimali e diafonia epiteliale. Le cellule immunitarie possono anche essere aggiunti al derma per studiare la risposta infiammatoria a perturbazioni nella pelle. Una limitazione del sistema è che il processo di desquamazione che si verifica in vivo non si verifica in colture organotipiche. Ciò impedisce l'uso di queste colture a lungo termine e più analisiavviene tra 1-14 giorni dopo la semina delle cellule epidermiche. Per i saggi a più lungo termine, le colture organotipiche possono essere innestate sulle spalle dei topi immuni compromessi 17,27.
La cultura organotipica pelle qui presentato è unico in quanto utilizza intatte derma umano devitalizzati che è il substrato naturale dell'epidermide in vivo mentre la maggior parte di altri sistemi usano collagene o Matrigel come substrato 28. Configurazione di culture organotipiche pelle utilizzando substrati quali risultati Matrigel a stratificazione sottile e meno robusto dell'epidermide nella nostra esperienza. Il derma contiene seminterrato proteine di membrana di zona, tra cui la laminina e collagene, che permette alle cellule epidermiche di allegare, proliferano, si differenziano e stratificano 29. Uso di derma consente generazione di epidermide che imita la loro controparte in vivo. Così, le culture della pelle organotipiche possono essere estremamente prezioso per s tossicologiche e farmacologicheTUDI nei casi in cui studi su animali non sono ammessi (settore cosmetico) 30.
Utilizzando derma devitalizzati viene inoltre fornito con i propri inconvenienti poiché lo spessore del derma tra diversi donatori o anche all'interno dello stesso donatore può variare. Cellule epidermiche coltivate su derma spesse tendono a non proliferare e generare spessore dell'epidermide le cellule coltivate su derma sottili. Pertanto, è fondamentale scegliere derma spessore simili durante l'impostazione degli esperimenti confrontando campioni multipli. Un altro parametro critico è seminare lo stesso numero di cellule epidermiche tra differenti gruppi in modo che eventuali differenze riscontrate non è dovuto alle differenze nel numero iniziale di cellule seminate.
In conclusione, la coltura organotipica pelle può servire come un avanzato ed efficiente modello in vitro per la convalida vie molecolari in un contesto più fisiologica, che alla fine di accelerare la comprensione del gene Mechan normativoismi che sono importanti nella crescita epidermico e differenziazione.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportedby l'American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) e il Premio Biologia CIRM di base (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
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